(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210010722.X (22)申请日 2022.01.05 (71)申请人 云南瑞栢泰生物科技有限公司 地址 650217 云南省昆明市经济技 术开发 区信息产业基地春漫大道8 0号云南海 归创业园1幢9 28号 (72)发明人 许绍坤　覃卫红　张薇　王耕　 粟柯衡　 (74)专利代理 机构 北京成高专利代理事务所 (普通合伙) 16047 代理人 姚燕春 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01)C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 一种针对塞尼卡谷病毒的核酸快速检测方 法 (57)摘要 本发明公开了一种针对塞尼卡谷病毒的核 酸快速检测方法， 涉及核酸检测领域， 包括如下 检测方法： 步骤一： 检测试剂和材料准备， 检测试 剂包括以下成分： 检测猪是否感染塞尼卡谷的引 物组、 反应液、 阴性对照组材料、 感染塞尼卡谷病 毒的血清样本、 口蹄疫病毒核酸样本； 引物组包 括引物1、 引物2、 引物 3、 引物4、 引物5和引物 6， 且 引物组中各引物干粉1OD； 反应液包括反应浓缩 液和逆转录酶， 反应浓缩液包括DNA聚合酶、 Buffer、 dNTP、 MgSO4、 Betaine和荧光染料； 阴性 对照组材料包括不含目的基因反应液； 本发明的 试剂盒可用于多个检测平台上， 不仅可以用在基 因快速检测仪和定量PCR仪， 也可以用在其他可 以提供恒定温度的设备 上， 如金属浴等。 权利要求书1页 说明书5页 附图2页 CN 114262755 A 2022.04.01 CN 114262755 A 1.一种针对塞尼卡谷病毒的核酸快速检测方法， 其特征在于， 所述针对塞尼卡谷病毒 的核酸快速检测方法包括： 步骤一： 检测试剂和材料准备， 检测试剂包括以下成分： 检测猪是否感染塞尼卡谷的引 物组、 反应液、 阴性对照组材料、 感染塞尼卡谷病毒的血清样 本、 口蹄疫病毒核酸样 本； 引物 组包括引物1、 引物2、 引物3、 引物 4、 引物5和引物6， 且引物组中各引物干粉1OD； 反应液包括 反应浓缩液和逆转录酶， 反应浓缩液包括DNA聚合酶、 Buffer、 dNTP、 M gSO4、 Betaine和荧光 染料； 阴性对照组材 料包括不含目的基因反应液； 步骤二： 病毒RNA提取， 使用病毒RNA提取 试剂盒提取样本RNA； 步骤三： 引物稀释， 将试剂盒中引物 1和引物2稀释成40nM,引物3和引物4稀释成5nM,引 物5和引物6稀释成20nM； 步骤四： 扩增反应 体系， 反应浓 缩液15ul， 引物组6ul,模板 3ul,去离 子无菌水1ul； 步骤五： 扩增曲线和溶解曲线获得， 将步骤四中的反应浓缩液、 引物 组、 模板、 去离子无 菌水混匀， 放入定量PCR仪， 设置65℃、 30s/循环， 60个循环， 可选循环完成后获得扩增曲线 和溶解曲线和基因快速检测系统中获得扩增曲线和溶解曲线； 步骤六： 判定， 根据步骤五所获得扩增曲线和溶解曲线 进行判定 。 2.根据权利要求1所述的一种针对塞尼卡谷病 毒的核酸快速检测方法， 其特征在于， 所 述引物1、 引物 2、 引物3、 引物4、 引物5和引物6具体为： 引物1： AGACGTC CTAGGTCGAGCCGCTCCTACACAGTGTC CA 引物2： AGGTCCACGACTCGATC CAGATCGC CTAGCTACAGTGC C 引物3： TGCAC CTCAGTTCACTG 引物4： CATCTGCTAC CTATAGACTCGA 引物5： CATGTACTCATG GTGGTAGCA 引物6： GCA ATAGGCTACAGTAGC 。 3.根据权利要求1所述的一种针对塞尼卡谷病 毒的核酸快速检测方法， 其特征在于， 所 述引物组设计根据3D 片段， 使用Primer  explorer软件设计引物组。 4.根据权利要求1所述的一种针对塞尼卡谷病 毒的核酸快速检测方法， 其特征在于， 所 述引物稀释过程中， 稀释引物要达到的浓度(pmol/ul)＝母 液浓度(pmol/ul) ×汲取母液的 体积(ul) ÷(汲取母液的体积(ul)+加水量(ul)。 5.根据权利要求1所述的一种针对塞尼卡谷病 毒的核酸快速检测方法， 其特征在于， 所 述引物组中引物1、 引物 2、 引物3、 引物4、 引物5和引物6对应目标序列8个特异区域。 6.根据权利要求1所述的一种针对塞尼卡谷病 毒的核酸快速检测方法， 其特征在于， 所 述基因快速检测系统中， 6 5℃、 30分钟， 获得扩增曲线和溶解曲线。 7.根据权利要求1所述的一种针对塞尼卡谷病 毒的核酸快速检测方法， 其特征在于， 所 述步骤六过程中， 根据所获得扩增曲线和溶解曲线进行判定， 扩增曲线有明显的 “S”型曲 线， 以及溶解曲线峰型单一且较为尖锐， 则判定为阳性结果； 扩增曲线没有出现明显 “S”型 曲线， 则判定为阴性结果； 扩增曲线有明显 “S”型曲线， 但溶解曲线不峰型单一判定为非特 异性扩增； 阴性质控品的检测结果是 阴性结果， 则是本次实验有效， 否则本次实验无效。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114262755 A 2一种针对塞尼卡谷病毒 的核酸快速检测方 法 技术领域 [0001]本发明涉及核酸检测领域， 具体是一种针对塞尼卡谷病毒的核酸快速检测方法。 背景技术 [0002]塞尼卡谷病毒， 是猪原发性疱 疹病的主要病原。 猪感染后通常表 现为急性、 自限性 水疱症状。 临床表现为采食量下降， 之后鼻吻出现水疱性病变， 可见1个或多个大小不一、 充 满液体的囊泡； 囊泡破裂后发展成溃疡病变， 在感染后10 ‑15d形成厚痂。 水疱性及溃疡性病 变多出现于蹄冠部趾间裂和冠状带周围， 导致边缘上皮疏松坏死， 严重者跛行， 站立困难。 有些母猪腹部和乳房部出现红色斑点， 或伴有发热和厌食症状， 甚至发烧39.5 ‑40.5℃， 部 分跛行的母猪体温可达4 1.0℃。 新生仔猪体态虚弱， 嗜睡， 不愿吸乳， 并出现急性死亡， 在蹄 掌部可见部分化脓性小泡。 塞尼卡谷病毒为小RNA病毒科塞尼卡病毒属的唯一成员。 SVV结 构呈二十面体， 直径25 ‑30nm， 无囊膜衣壳。 基因组为线性、 不分节段、 单股正链RNA， 全长约 7.2‑7.3kb， 5′和3′有非编码区， 具有多聚腺苷酸尾。 病毒基因含1个开放阅读 框(ORF)， 编码 含 2181个氨基酸的多聚蛋白前体， 之后被裂解为1个前导蛋白和3个主要多聚蛋白(P1、 P2 和P3)； P1基因区域主要编码4个结构蛋白(VP4、 VP2、 VP3  和VP1)， 形成病毒的核衣壳， 而P2 和P3基因区域编码7个非结构蛋白(2A、  2B、 2C、 3A、 3B、 3C和3D)； 通过对小RNA病毒科的12 个 代表性病毒属病毒进 行全基因组序列比对发现， 塞尼卡病毒属与心肌炎病毒属遗传关系最 近。 目前， 北美、 南美地区以及 澳大利亚都有猪群发生SIVD的报道。 我国于2016  年也首次分 离到了SVV， 鉴于其对仔 猪较高的致病性， 应加以关注。 [0003]目前检测塞尼卡谷的方法有RT ‑PCR、 荧光定量PCR、 ELISA、 病毒分离、 病毒中和等 SVV实验室诊断方法， 但上述方法操作繁琐， 需依赖昂贵的仪器， 且耗时较长， 在2h以上。 因 此建立快速、 准确、 灵敏、 特异的现场检测方法对塞尼卡谷病的预防与控制具有重大意 义。 [0004]因此， 本领域技术人员提供了一种针对塞尼卡谷病毒的核酸快速检测方法， 以解 决上述背景技 术中提出的问题。 发明内容 [0005]本发明的目的在于提供一种针对塞尼卡谷病毒的核酸快速检测方法， 以解决上述 背景技术中提出的目前检测 塞尼卡谷的方法有RT ‑PCR、 荧光定量PCR、 ELISA、 病毒分离、 病 毒中和等SVV实验室诊断方法， 但上述方法操作繁琐， 需依赖昂贵的仪器， 且耗时较长， 在2h 以上。 因此建立快速、 准确、 灵敏、 特异的现场检测方法对塞尼卡谷病的预防与控制具有重 大意义的问题。 [0006]为实现上述目的， 本发明提供如下技 术方案： [0007]一种针对塞尼卡谷病毒的核酸快速检测方法， 包括： [0008]步骤一： 检测试剂和材料准备， 检测试剂包括以下成分： 检测猪是否感染塞尼卡谷 的引物组、 反应液、 阴性对照组材料、 感染塞尼卡谷病毒的血清样本、 口蹄疫病毒核酸样本； 引物组包括引物1、 引物2、 引物3、 引物 4、 引物5和引物6， 且引物组中各引物干粉1OD； 反应液说　明　书 1/5 页 3 CN 114262755 A 3