(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210012531.7 (22)申请日 2022.01.06 (71)申请人 扬州大学 地址 225009 江苏省扬州市大 学南路88号 (72)发明人 任战士　范海瑞　吴圣龙　吴正常　 包文斌　 (74)专利代理 机构 南京纵横知识产权代理有限 公司 32224 专利代理师 董建林 (51)Int.Cl. C12N 15/113(2010.01) C12N 15/85(2006.01) C12N 15/89(2006.01) C12N 15/54(2006.01) A01K 67/027(2006.01)C12Q 1/6888(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) A61K 49/00(2006.01) (54)发明名称 一种Sec1基因敲除小鼠模型的sgRNA、 构建 方法及其应用 (57)摘要 本发明公开了一种构建Sec1基因敲除小鼠 模型的方法， 属于生物技术领域。 采用Cas9/sg   RNA注射受精卵的方法构建Sec1基因大片段敲除 的小鼠模型， 鉴定出野生型小鼠、 杂合型小鼠和 纯合型小鼠并对其进行表型分析、 病理学分析、 敲除前后对个体的影响和对睾丸发育、 生精能力 以及精子品质的影 响的测定， 以及Sec1基因本身 的功能和分子机制分析， 以期为该基因相关数据 的补充和对个体功能的影响的数据探究提供了 新的依据。 权利要求书2页 说明书8页 附图4页 CN 115058418 A 2022.09.16 CN 115058418 A 1.一种构建Sec1基因敲 除小鼠模型的sgRNA， 其特征在于， 包括靶向Sec1基因的第4号 外显子的第61个碱基处的sgRNA和靶向Sec1基因的第4号外显子的第1270个碱基处的 sgRNA； 靶向Sec1基因的第4 号外显子的第61个碱基处的sgRNA序列为： gRNA1： CCTCTTCTTCGTGATTTTCGTGG； 靶向Sec1基因的第4 号外显子的第1270个碱基处的sgRNA序列为： gRNA2： GGCCTACCATTCGCTGCATCTG G。 2.一种基因敲除载体， 其特征在于， 将如权利要求1所述的双sgRNA重组入表达载体中， 得到基因敲除载体。 3.一种Sec1基因敲除小鼠模型的构建方法， 其特征在于， 采用权利要求1所述的sgRNA 与Cas9核酸酶的mRNA经体外转录后， 一起注射到小鼠受精卵中， 然后将受精卵移植到假孕 母鼠体内， 获得嵌合体的F0代； 对F0代进行PCR鉴定， 将阳性F0代小鼠与野生型小鼠交配获 得具有稳定基因型的F1代小鼠， 筛选Sec1基因敲除的纯合子代， 作为Sec1基因敲除小鼠模 型。 4.一种Sec1基因敲除小鼠模型， 其特 征在于， 由权利要求3所述方法构建而成。 5.权利要求4所述的Sec1基因敲除小鼠模型的鉴定方法， 其特征在于， 鉴定小鼠基因型 的引物序列如下： F1:5’ ‑AGGTGACAGA AAGATTCAGAGGTAC‑3’ R1:5’ ‑GAGTGAGTGTGAGTGTGCTAGA AAC‑3’ F1:5’ ‑AGGTGACAGA AAGATTCAGAGGTAC‑3’ R2:5’ ‑AGTGCAAACAGCGTG GCATATTC‑3’。 6.根据权利要求5所述的鉴定方法， 其特征在于， 野生型个体有1765/446bp的PCR产物， 纯合敲除小鼠只有5 55bp的PCR产物， 杂合个 体则有三种产物。 7.根据权利要求5所述的鉴定方法， 其特征在于， 采集鼠尾和脚趾提取基因组DNA为模 板进行PCR鉴定 。 8.根据权利要求5所述的鉴定方法， 其特 征在于， PCR反应 体系为： 9.根据权利要求5所述的鉴定方法， 其特 征在于， PCR反应条件为：权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115058418 A 210.权利要求4所述Sec1基因敲除小鼠模型在制备靶向雄性哺乳动物精子质量降低的 药物中的应用。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115058418 A 3