(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210009578.8 (22)申请日 2022.01.06 (71)申请人 广西壮族自治区林业科 学研究院 地址 530002 广西壮 族自治区南宁市 兴宁 区邕武路23号 (72)发明人 张照远　郝丙青　叶航　马锦林　 孟中磊　陈国臣　王东雪　蔡娅　 吴方圆　戴艳花　 (74)专利代理 机构 北京圣州专利代理事务所 (普通合伙) 11818 代理人 何世常 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12Q 1/6869(2018.01)C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种基于DNA条形码准确鉴定香花油茶的方 法 (57)摘要 本发明公开了一种基于DNA条形码准确鉴定 香花油茶的方法， 步骤如下： S1、 提取待测物种的 全基因组DNA； S2、 利用DNA条形码引物进行PCR扩 增， 得到PCR扩增产物； S3、 电泳检测PCR产物， 如 果没有目标条带， 则判定待测物种不是香花油 茶， 如果有目标条带， 则进行下一步； S4、 对所得 PCR产物进行测序， 得到待测核苷酸序列； 将所述 待测核苷 酸序列与 DNA条形码的核苷酸序列进行 同源性比对， 鉴别香花油茶物种， 并进行系统发 育树分析。 本发明采用上述的一种基于DNA条形 码准确鉴定香花油茶的方法， 通过条形码组合在 基因组范围内实现阶层条形码， 达到物种自动鉴 定的目的。 权利要求书1页 说明书4页 序列表2页 附图2页 CN 114214453 A 2022.03.22 CN 114214453 A 1.一种基于DNA条 形码准确鉴定香 花油茶的方法， 其特 征在于， 步骤如下： S1、 提取待测物种的全基因 组DNA； S2、 利用DNA条 形码引物进行PCR扩增， 得到PCR扩增产物； S3、 电泳检测 PCR产物， 如果没有目标条带， 则判定待测物种不是香花油茶， 如果有目标 条带， 则进行 下一步； S4、 对所得PCR产物进行测序， 得到待测核苷酸序列； 将所述待测核苷酸序列与DNA条形 码的核苷酸序列进行同源性比对， 鉴别香 花油茶物种， 并进行系统发育树分析。 2.根据权利要求1所述的一种基于DNA条形码准确鉴定香花油茶的方法， 其特征在于： DNA条形码引物包括matK引物、 rbcL引物或t rnH‑psbA引物中的一种或多种。 3.根据权利要求2所述的一种基于DNA条形码准确鉴定香花油茶的方法， 其特征在于， matK的扩增引物为： 正向引物5 ’ ‑TCCATGGGTTTATATGGATCCTTCCTGGTT‑3’； 反向引物5 ’ ‑CCCGCCATGGATGGAAGAATTCAAAAGATA‑3’。 4.根据权利要求2所述的一种基于DNA条形码准确鉴定香花油茶的方法， 其特征在于， rbcL的扩增引物为： 正向引物5 ’ ‑ATGTCACCACAAACAGAGACTA AAGC‑3’ 反向引物5 ’ ‑GTAAAATCAAGTCCACCRCG‑3’。 5.根据权利要求2所述的一种基于DNA条形码准确鉴定香花油茶的方法， 其特征在于， trnH‑psbA的扩增引物为： 正向引物5 ’ ‑CGCGCATG GTGGATTCACAATCC‑3’ 反向引物5 ’ ‑GTTATGCATGA ACGTAATGCTC‑3’。 6.根据权利要求1所述的一种基于DNA条形码准确鉴定香花油茶的方法， 其特征在于， 步骤S2中PCR扩增体系为： 10 μL  2×PCR扩增体系混合液， 10 μM引物对， 30ng的DNA模板， 反应 体系终体积20 μL； PCR反应条件为94℃反应3min； 然后94℃变性35s， 55℃退火30s， 72℃延展 1min， 如此35 个循环； 最后72℃延展7mi n。 7.一种基于DNA条形码准确鉴定香花油茶的试剂盒， 其特征在于： 所述试剂盒中含有如 权利要求3 ‑5任一项所述的引物对。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114214453 A 2一种基于DNA条形码准确鉴定香 花油茶的方 法 技术领域 [0001]本发明涉及生物鉴定技术领域， 尤其是涉及一种基于DNA条形码准确鉴定香花油 茶的方法。 背景技术 [0002]花油茶(Camellia  osmantha  Ye CX,Ma JL et Ye H.)是2012年在广西南宁发现 的一种山茶属短柱茶组新种， 不仅早熟、 果量多、 出籽率高， 而且属性美观、 花带香气， 也称 为香花油茶。 目前， 经过几年的研究和积累， 已选育出大量香花油茶的优良单株、 无性系和 家系。 [0003]但是， 由于香花油茶的遗传背景较为复杂， 目前为止， 一直没有有效的分子遗传鉴 定系统对香花油茶进行遗传进化分析， 使香花油茶分子水平上的研究受到极大限制 。 为了 更大范围地推广香花油茶， 目前甚至未来更长时间， 需要更加深入了解香花油茶的遗传机 理。 [0004]DNA条形码技术(DNA  barcoding)是利用标准、 有足够变异、 易扩增且相 对较短的 DNA片段(DNA  barcode)自身在物种种内的特异性和种间的多样性而创建的一种新的身份 识别系统， 它可以对物种进行 快速的自动鉴定 。 [0005]在植物中， 谱系偏选和杂交现象非常普遍， 而山茶属种类繁多， 油茶的遗传结构和 系统演化关系更为复杂， 增加了筛选DNA条形码的难度， 这样就更需要从不同的基因组中选 择基因来保证鉴定的准确度。 [0006]植物叶绿体基因组(cpDNA)为单亲遗传， 其DNA片段容易扩增和测序。 叶绿体基因 matK、 rbcL、 trnH ‑psbA、 ycf1等具有进 化速率快、 大小片段适中、 种间差异度高且碱基转换/ 颠换数低、 序列信息数据庞大， 引物通用性好、 序列扩增率高等特点， 因此被广泛用来进行 DNA条形码分析， 在药用植物、 木兰科等 植物中已成功应用。 发明内容 [0007]本发明的目的是提供一种基于DNA条形码准确鉴定香花油茶的方法， 通过条形码 组合在基因 组范围内实现阶层条 形码， 逐级缩小范围， 达 到物种自动鉴定的目的。 [0008]为实现上述目的， 本发明提供了一种基于DNA条形码准确鉴定香花油茶的方法， 步 骤如下： [0009]S1、 提取待测物种的全基因 组DNA； [0010]S2、 利用DNA条 形码引物进行PCR扩增， 得到PCR扩增产物； [0011]S3、 电泳检测PC R产物， 如果没有目标条带， 则判定待测物种不是香花油茶， 如果有 目标条带， 则进行 下一步； [0012]S4、 对所得PC R产物进行测序， 得到待测核苷酸序列； 将所述待测核苷酸序列与D NA 条形码的核苷酸序列进行同源性比对， 鉴别香 花油茶物种， 并进行系统发育树分析。 [0013]优选的， DNA条形码引物包括matK引物、 rbcL引物或trnH ‑psbA引物中的一种或多说　明　书 1/4 页 3 CN 114214453 A 3