(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210014166.3 (22)申请日 2022.01.06 (71)申请人 南京海关动植物与食品检测中心 地址 210019 江苏省南京市 建邺区创智路 39号 (72)发明人 李井干　吴晶　刘晓宇　伏建国　 余本渊　杨晓军　 (74)专利代理 机构 北京太兆天元知识产权代理 有限责任公司 1 1108 代理人 张洪年 (51)Int.Cl. C12Q 1/6851(2018.01) C12Q 1/6895(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种鉴别勃氏牡丹的引物、 试剂、 鉴别方法 及试剂盒 (57)摘要 本发明涉及鉴别领域， 特别是涉及濒 危野生 动植物的鉴别领域， 更为具体的说是涉及一种鉴 别勃氏牡丹的引物、 试剂、 鉴别方法及试剂盒， 通 过对岩牡丹属植物进行转录组测序和分析， 发现 勃氏牡丹与其他的岩牡丹属植物相比较， 在PEPC (磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因)功能基因序列 上存在11个碱基的突变位点。 进一步筛选其中的 9个碱基的突变位点进行设计， 从而获得勃氏牡 丹的实时荧光定量PCR的特异性引物和荧光探 针， 用于研究勃氏牡丹的分子鉴别方法， 并检测 该方法的灵敏度， 为濒危物种的鉴别提供新的技 术路线。 权利要求书1页 说明书4页 序列表2页 附图3页 CN 114231603 A 2022.03.25 CN 114231603 A 1.一种鉴别勃氏牡丹的引物， 其特征在于： 所述鉴别勃氏牡丹的引物包括包括上游引 物和下游引物， 上游引物为5 ′ ‑CTGGATTTCTCTTGAGCTGTGA ‑3′(SEQ ID NO： 1)， 下游引物为 5′ ‑GGAAGGAAATAGAATGTGGGTT‑3′(SEQ ID NO： 2)。 2.一种鉴别勃氏牡丹的试剂， 其特征在于： 包括权利要求1所述的引物， 还包括有荧光 探针， 所述 荧光探针的序列为5 ′TGTATCCTATTAGGCTATTACCTGACACC‑3′(SEQ ID NO： 3)。 3.根据权利要求2所述的鉴别勃氏牡丹的试剂， 其特征在于： 探针5 ′端标记荧光报告基 团FAM， 3′端标记不发荧 光的淬灭基团BHQ1。 4.鉴别勃氏牡 丹的方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： S1： 提取样品植物DNA； S2： 以权利 要求2或3所述的上游引物、 下游引物及探针形成的PCR反应体系对S1中提取 的样品植物DNA进行扩增反应； S3： 如果有典型的扩增曲线， 表明该待测的样品植物为勃氏牡丹； 如果没有典型的扩增 曲线， 说明该待测的样品植物不 为勃氏牡 丹。 5.根据权利要求 4所述的鉴别勃氏牡 丹的方法， 其特 征在于： S2中的退火温度为6 0℃。 6.根据权利 要求4或5所述的鉴别勃氏牡丹的方法， 其特征在于： S2中PCR反应参数为94 ℃， 15s； 6 0℃， 1min； 40个循环。 7.鉴别勃氏 牡丹的试剂盒 ， 其特征在于 ： 所述试剂盒中包括上游引物5 ′ ‑ CTGGATTTCTCTTGAGCTGTGA ‑3′(SEQ ID NO： 1)， 下游引物5 ′ ‑GGAAGGAAATAGAATGTGGGTT ‑3′ (SEQ ID NO： 2)， 荧 光探针5′ ‑FAM‑TGTATCCTATTAGGCTATTACCTGACACC‑BHQ1‑3′。 8.根据权利要求7所述的鉴别勃氏牡丹的试剂 盒， 其特征在于： 所述试剂 盒的反应体系 为上游引物(10mol/L)0.8 μL； 下游引物(10mol/L)0.8 μL； 探针(10mol/L)0.4 μL； ROX  0.4 μL； DNA模板2.0 μL； 余 量为水， 总体积20.0 μL。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114231603 A 2一种鉴别勃氏牡丹的引物、 试剂、 鉴别方 法及试剂盒 技术领域 [0001]本发明涉及鉴别领域， 特别是涉及濒危野生动植物的鉴别领域， 更为具体的说是 涉及一种鉴别勃氏牡 丹的引物、 试剂、 鉴别方法及试剂盒。 背景技术 [0002]勃氏牡丹Ariocarpus  bravoanus属仙人掌科岩牡丹属， 原产墨西哥。 勃氏牡丹在 世界自然保护 联盟(IUCN)濒危物种红色名录中被评为 “濒危”级别， 同时被列入 《濒危野生 动植物种国际贸易公约》 (简称为 《公约》 )。 [0003]对于勃氏牡丹的鉴别目前仍以形态学为主， 而生态学鉴别对于专业鉴别人员的依 赖性很重， 这就导致各海关口岸无法在鉴别过程中需要配备大量的形态鉴别专家。 人才短 缺， 以及形态学鉴别中依赖人工观察， 对于与勃氏牡丹形态上较为相似的龟甲牡丹、 龙舌兰 牡丹的干扰， 使得勃氏牡 丹的鉴别成为海关口岸查验工作的亟 待解决的问题。 发明内容 [0004]本发明所要解决的技术问题是如何突破勃氏牡丹鉴别中对形态学专家的依赖性， 提供一种新的鉴别方法， 从而缓解人才压力， 同时避免人工鉴别中由于人为因素造成的误 判。 [0005]为了解决上述技术问题， 本发明公开了一种鉴别勃氏牡丹的引 物， 所述引 物包括 上游引物和下游引物， 上游引物为5 ′ ‑CTGGATTTCTCTTGAGCTGTGA ‑3′  (SEQ ID NO： 1)， 下游 引物为5′ ‑GGAAGGAAATAGAATGTGGGTT‑3′(SEQ ID NO： 2)。 [0006]进一步地， 在本发明中还进一步公开了一种鉴别勃氏牡丹的试剂， 所述的试剂中 包括有PCR引物及荧光探针， 其中PCR引物包括上游引物和下游引物， 上游引物为5 ′ ‑ CTGGATTTCTCTTGAGCTGTGA ‑3′(SEQ ID NO： 1)， 下游引物为5 ′   ‑GGAAGGAAATAGAATGTGGGTT ‑ 3′(SEQ ID NO： 2)， 探针序列为5 ′  TGTATCCTATTAGGCTATTACCTGACACC‑3′(SEQ ID NO： 3)。 [0007]优选地， 所述荧光探针5 ′端含有FAM荧光报告基团， 3 ′端含有不发荧光的淬灭基团 BHQ1。 [0008]进一步地， 在本发明 中还公开了鉴别勃氏牡 丹的方法， 包括以下步骤： [0009]S1： 提取样品植物DNA； [0010]S2： 以前述上游引物、 下游引物及探针形成的PC R反应体系对S1中提取的样品植物 DNA进行扩增反应； [0011]S3： 如果有典型的扩增曲线， 表明该待测的样品植物为勃氏牡丹； 如果没有典型的 扩增曲线， 说明该待测的样品植物不 为勃氏牡 丹。 [0012]优选地， 在本发明 中还公开了前述两个扩增反应S2中的退火温度为6 0℃。 [0013]进一步优选地， 本发明中还公开了前述两个扩增反应S2中PCR反应参数为  94℃， 15s； 60℃， 1min； 40个循环。 [0014]同时， 在本发明中还公开了鉴别勃氏牡丹的试剂盒， 所述试剂盒中包括上游引 物说　明　书 1/4 页 3 CN 114231603 A 3