(19)国家知识产权局 (12)发明 专利 (10)授权公告 号 (45)授权公告日 (21)申请 号 202210013045.7 (22)申请日 2022.01.06 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 114410810 A (43)申请公布日 2022.04.29 (73)专利权人 广州蔚捷生物医药 科技有限公司 地址 510663 广东省广州市黄埔区科丰路 31号G12栋20 3房 (72)发明人 朱兴彪　张友兵　徐贵峰　马星星　 方洁　赵京鹏　 (74)专利代理 机构 广州嘉权专利商标事务所有 限公司 4 4205 专利代理师 齐键 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01)C12Q 1/6851(2018.01) C12Q 1/04(2006.01) C12N 15/11(2006.01) 审查员 毛颖 (54)发明名称 一种检测非结核分枝 杆菌的试剂盒、 检测方 法及其应用 (57)摘要 本发明公开了一种检测非结核分枝杆菌的 试剂盒、 检测方法及其应用， 通过设计得到的特 异性引物组合探针组， 实现了对14种非结核分枝 杆菌的快速和准确的检测和鉴定， 对引物组进行 多重荧光PCR扩增得到的扩增产物进行熔解曲线 分析， 获得熔解温度， 依据熔解温度能够快速准 确的对14种非结核分枝杆菌进行检测。 且本发明 中的PCR‑HRM检测方法具有较高的检测通量， 显 著缩短了非结核分枝杆菌的检测时间， 此外， 本 发明中的PCR ‑HRM检测方法还具有真实性高、 准 确性高、 特异性强、 灵敏度高以及抗干扰物能力 强的优点， 比临床一般要求的灵敏度敏感10 ‑20 倍。 权利要求书4页 说明书20页 序列表4页 附图7页 CN 114410810 B 2022.10.04 CN 114410810 B 1.一种非结核分枝杆菌的荧光定量PCR ‑HRM检测试剂盒， 其特征在于， 所述检测试剂盒 中含有引物组和探针组； 所述引物组的核苷酸序列为： NMT引物对： NMT‑F： 5'‑AGAAGACCGACGACGTBGC ‑3'； NMT‑R： 5'‑RTCTSGGTGAYCTTYTCSAC‑3'； 和人源内标基因引物对： 人源内标基因 ‑F： 5'‑TAGGGAGTATATAG GTTGGGGAAGTT‑3'； 人源内标基因 ‑R： 5'‑AACACACAATAACAAACACAAATTCAC‑3' 所述探针组的核苷酸序列为： 戈尔登分枝杆菌： gordo nae‑P2探针： 5' ‑CCACCGTGCTGGCGCAGG‑3'； 脓肿分枝杆菌： absces sus‑P2探针： 5' ‑TTCTTGCCCAGGCCCTGGTCAAG‑3'； 鸟分枝杆菌复合群： avium ‑HSP‑P1探针： 5' ‑CACGGTGCTCGC CCAGGCGTTGG‑3'； 亚洲分枝杆菌： arisiense ‑HSP‑P1探针： 5' ‑ACGACGGCGACGGTGCTGGCC‑3'； 偶发分枝杆菌： for tuitum‑HSP‑P2探针： 5' ‑TTCTGGCACAGGCCCTGGTT‑3'； 嗜血分枝杆菌： haemophi lum‑HSP‑P2探针： 5' ‑CACGACGGCGACGGTGCTG‑3'； 胞内分枝杆菌： i ntercelleulare‑HSP‑P2探针： 5' ‑CTGGCTCAGGCGTTGGTCC‑3'； 堪萨斯分枝杆菌： kansasi i‑HSP‑P2探针： 5' ‑CTCGCGCAG GCGTTGGTCAAAGA‑3'； 玛尔摩分枝杆菌： malmoense ‑HSP‑P2探针： 5' ‑CTGGCGCAGGCGCTGGTCAA‑3'； 瘰疬分枝杆菌： scrofulaceum ‑HSP‑P3探针： 5'‑CCACGGTGCTGGCCCAGGC‑3'； 苏尔加分枝杆菌： szulg ai‑HSP‑P1探针： 5' ‑CTCGCCCAGGCGCTGGTGCG‑3'； 蟾蜍分枝杆菌： xen opi‑HSP‑P2探针： 5' ‑ACGGCGACCGTGCTGGCGC‑3'； 猿猴分枝杆菌： simiae ‑HSP‑P1探针： 5' ‑CTCGCTCAG GCGCTCGTCA A‑3'； 龟分枝杆菌： c helonae‑HSP‑P1探针： 5' ‑TGCTGGCCCAGGCGCTGGTCAAGG‑3'； 人源内标基因 ‑P3探针： 5'‑ACTGCGTGTG GGGTGGTGATGGAGGA‑3'； 所述探针组的序列两端分别标有荧光基团和淬灭基团， 各探针序列 标记的荧光基团和 淬灭基团不相同； 其中， gordonae、 abscessus、 kansasii 和malmoense 探针序列 标记的荧光 基团都为FA M，avium、 ari siense、 scrofu laceum和szulgai探针序列标记的荧光基团为HE X， fortuitum、 haemophilum、 xenopi 和simiae 探针序列标记的荧光基团为TAMRA， intercelleulare、 chelonae 和人源内标基因探针标记的荧光基团为CY5； gordonae、 abscessus、 kansasii、 malmoense、 avium、 arisiense 和scrofulaceum 的淬灭基团是BHQ1， szulgai和fortuitum的淬灭基团是BHQ2， haemophilum、 xenopi、 simiae、 inter celleulare、 chelonae 和人源内标基因探针的淬灭基团是BHQ3 。 2.根据权利要求1所述的荧光定量PCR ‑HRM检测试剂盒， 其特征在于， 所述PCR ‑HRM检测 试剂盒中还包括脱氧核糖核苷三磷酸、 Buffer混合液、 阳性对照、 阴性对照和DNA聚合酶中 的一种或几种。 3.引物组和探针组在制备荧 光定量PCR ‑HRM检测试剂盒中的应用； 所述引物组的核苷酸序列为： NMT引物对：权　利　要　求　书 1/4 页 2 CN 114410810 B 2NMT‑F： 5'‑AGAAGACCGACGACGTBGC ‑3'； NMT‑R： 5'‑RTCTSGGTGAYCTTYTCSAC‑3'； 和人源内标基因引物对： 人源内标基因 ‑F： 5'‑TAGGGAGTATATAG GTTGGGGAAGTT‑3'； 人源内标基因 ‑R： 5'‑AACACACAATAACAAACACAAATTCAC‑3' 所述探针组的核苷酸序列为： 戈尔登分枝杆菌： gordo nae‑P2探针： 5' ‑CCACCGTGCTGGCGCAGG‑3'； 脓肿分枝杆菌： absces sus‑P2探针： 5' ‑TTCTTGCCCAGGCCCTGGTCAAG‑3'； 鸟分枝杆菌复合群： avium ‑HSP‑P1探针： 5' ‑CACGGTGCTCGC CCAGGCGTTGG‑3'； 亚洲分枝杆菌： arisiense ‑HSP‑P1探针： 5' ‑ACGACGGCGACGGTGCTGGCC‑3'； 偶发分枝杆菌： for tuitum‑HSP‑P2探针： 5' ‑TTCTGGCACAGGCCCTGGTT‑3'； 嗜血分枝杆菌： haemophi lum‑HSP‑P2探针： 5' ‑CACGACGGCGACGGTGCTG‑3'； 胞内分枝杆菌： i ntercelleulare‑HSP‑P2探针： 5' ‑CTGGCTCAGGCGTTGGTCC‑3'； 堪萨斯分枝杆菌： kansasi i‑HSP‑P2探针： 5' ‑CTCGCGCAG GCGTTGGTCAAAGA‑3'； 玛尔摩分枝杆菌： malmoense ‑HSP‑P2探针： 5' ‑CTGGCGCAGGCGCTGGTCAA‑3'； 瘰疬分枝杆菌： scrofulaceum ‑HSP‑P3探针： 5'‑CCACGGTGCTGGCCCAGGC‑3'； 苏尔加分枝杆菌： szulg ai‑HSP‑P1探针： 5' ‑CTCGCCCAGGCGCTGGTGCG‑3'； 蟾蜍分枝杆菌： xen opi‑HSP‑P2探针： 5' ‑ACGGCGACCGTGCTGGCGC‑3'； 猿猴分枝杆菌： simiae ‑HSP‑P1探针： 5' ‑CTCGCTCAG GCGCTCGTCA A‑3'； 龟分枝杆菌： c helonae‑HSP‑P1探针： 5' ‑TGCTGGCCCAGGCGCTGGTCAAGG‑3'； 人源内标基因 ‑P3探针： 5'‑ACTGCGTGTG GGGTGGTGATGGAGGA‑3'； 所述探针组的序列两端分别标有荧光基团和淬灭基团， 各探针序列 标记的荧光基团和 淬灭基团不相同； 其中， gordonae、 abscessus、 kansasii 和malmoense 探针序列 标记的荧光 基团都为FA M，avium、 ari siense、 scrofu laceum和szulgai探针序列标记的荧光基团为HE X， fortuitum、 haemophilum、 xenopi 和simiae 探针序列标记的荧光基团为TAMRA， intercelleulare、 chelonae 和人源内标基因探针标记的荧光基团为CY5； gordonae、 abscessus、 kansasii、 malmoense、 avium、 arisiense 和scrofu