(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210009823.5 (22)申请日 2022.01.06 (71)申请人 杭州艾迪康医学检验中心有限公司 地址 310023 浙江省杭州市西湖区振中路 208号2幢北楼1至 5层 (72)发明人 王淑一　张敏　 (74)专利代理 机构 浙江杭州金通专利事务所有 限公司 3 3100 代理人 黄素萍　徐关寿 (51)Int.Cl. C12Q 1/6883(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12Q 1/6869(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种检测LZTFL1基因rs11385942的GAA 碱基 变异的引物， 方法和应用 (57)摘要 本发明提供了一种使用RT ‑PCR及Sanger测 序法检测LZTFL1基因rs11385942的GAA 碱基变异 的引物， 方法及应用。 本发明所述的引物和检测 方法， 能够方便快捷、 经济， 有助于快速、 准确地 检测LZTFL1基因rs11385942的GAA碱基变异状 况， 对于目前判断新冠感染后疾病的严重程度， 治疗， 用药和预后有极大的指导 意义。 权利要求书1页 说明书5页 序列表1页 附图1页 CN 114277125 A 2022.04.05 CN 114277125 A 1.一种以cDNA为模板使用Sanger测序法检测LZTFL1基因rs11385942的GAA碱基变异的 引物， 其特 征在于， 所述扩增引物序列包括： LZTFL1‑MF:5’ ‑CTTGAGGTGCTATGAG GAGA‑3’ LZTFL1‑MR:5’ ‑ATGCCAGAAATCAGGAAGGA‑3’ 所述测序引物的核苷酸序列包括： LZTFL1‑MF:5’ ‑CTTGAGGTGCTATGAG GAGA‑3’ LZTFL1‑MR:5’ ‑ATGCCAGAAATCAGGAAGGA‑3’。 2.根据权利要求1所述的引物， 其特征在于， 检测LZTFL1基因rs11385942的GAA碱基变 异分别是GA ‑， GAAA。 3.检测LZTFL1基因rs1 1385942的GA A碱基变异的方法， 包括以下步骤： 1)提取人全血样本中的RNA， 逆转录获得cDNA； 2)利用扩增引物进行PCR扩增， 得到扩增产物； 所述PCR扩增条件为： 94℃5min； 98℃ 10s， 58℃25s， 68℃3 0s， 共40个 循环； 68℃2mi n； 3)使用酶法纯化PCR产物； 4)利用测序引物进行Sanger测序， 得到不同片段长度的测序产物； 所述测序反应条件 为： 95℃预变性 4min； 95℃变性15s， 5 0℃退火20s， 68℃延伸2mi n， 25个循环； 5)测序产物纯化及上测序仪进行测序； 6)对得到的测序结果进行分析； 所述扩增引物的核苷酸序列包括： LZTFL1‑MF:5’ ‑CTTGAGGTGCTATGAG GAGA‑3’ LZTFL1‑MR:5’ ‑ATGCCAGAAATCAGGAAGGA‑3’ 所述测序引物的核苷酸序列包括： LZTFL1‑MF:5’ ‑CTTGAGGTGCTATGAG GAGA‑3’ LZTFL1‑MR:5’ ‑ATGCCAGAAATCAGGAAGGA‑3’。 4.根据权利要求3所述的方法， 其特征在于， 检测LZTFL1基因rs11385942的GAA碱基变 异分别是GA ‑， GAAA。 5.根据权利要求 4所述的方法， 其特 征在于， 所述GA A变异的原 始序列是： CTCTGCATGTGA AC。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114277125 A 2一种检测LZTFL1基因r s11385942的GA A碱基变异的引物， 方 法 和应用 技术领域 [0001]本发明属生命科学和生物技术领域， 一种使用RT ‑PCR及sanger测序法检测LZTFL1 基因rs11385942的GA A碱基变异的引物， 方法及应用。 技术背景 [0002]LZTFL1位于染色体3p21.3区域， 由Kiss.H  et al用消除试验首次从该区域克隆出 人源和鼠源LZTFLl  gene。 LZTFLl(1eucine  zipper transcriptionfactor ‑like 1)(类亮 氨酸拉链转录因子)， 基于预测存在于其上的亮氨 酸具有拉链式螺旋区域。 人类LZT FLl开放 阅读框架约为897bp， 编码299个氨基酸， 其分子量大小约为34.6KDa。 其在基因组和cDNA水 平的第860个碱基的位置存在一个相对不保守的突变位点， 存在天冬酰胺和天冬氨酸之间 的置换。 LZTFL1  cDNA存在两个多聚腺苷化位点， 分别位于1464bp和3361bp位点， 这与 Northem Blot结果相一致。 Northern  Blot证实LZTFLl通过这种可选择的多聚腺苷化来调 控LZTFLl  mRNA的时空表达。 短的转录子主要集中表达在睾丸， 少见于心脏、 骨骼肌、 胚肾等 组织， 而长转录子少见表达于肝、 卵巢、 小肠和结肠等组织。 LZT FL1包含了亮氨 酸拉链结构， 亮氨酸拉链为形成同源二聚体和异 二聚体提供结构 基础， 这种异二聚体结构为基因调控的 联合控制提供了 重要的分子结构上的机制， 提 示LZTFL1在基因的调控中可能起重要作用。 [0003]大量研究发现LZTFL1基因和肿瘤相关， 原因是人类LZTFL1位于染色体3p21.3区 域， 此区域是众多肿瘤抑制基因所在的热点区域； 3p21.3着丝粒的关键区域边界(也叫 LUCA)大约120BP处现已发现9 个肿瘤抑制基因； LZTFL1广泛表达于正常组织中的上皮细胞， 而在相应的肿瘤样本中表达显著下降； 正常分化的肠上皮细胞中， LZTFLl的表达与 E.cadherin在质膜上重叠， 而在结肠肿瘤中， 由于LZTFL1的表达缺失， 不具有共定位的特 征。 另外研究也发现LZTFL1基因与一类由纤毛功能障碍引起的遗传性疾病相关。 [0004]2019年全球新冠发生以来， 人们发现大量的个体感染了新冠后 症状很轻或没有症 状， 而一些个体就 非常严重甚至引起呼吸衰竭。 为了研究这种情况， 科学界进 行了大量分子 检测， 发现感染新冠后的严重程度和3p21.3上的多个基因位点相关， 其中rs11385942 (GAAA/GA ‑)增加或缺失 “A”和感染新冠后严重程度相关， 并且基因型GAA的病人需要呼吸机 的机会明显高于其它基因型， 而rs11385942(GAAA /GA‑)是LZTFL1基因的一个SNP。 因此检测 LZTFL1基因的rs1 1385942(GA AA/GA‑)是非常重要， 有利于疾病严重程度的判断。 [0005]目前用于检测LZTFL1基因rs11385942的GAA碱基变异的方法主要有： Sanger测序 法和NGS(Next ‑generation  sequencing  technology)测序。 Sanger测序法目前是临床应用 于检测基因突变极其普遍的一种手段， 应用灵活， 但是其灵敏度不高， 且每次测序长度较为 有限， 一般一次测序只能测定800bp左右的基因片段。 目前LZTFL1测序主要是以DNA为模板 进行PCR扩增， 因为测序片段限制， 通常两个热点区域需要进 行分别扩增， 增加了检测成本。 NGS测序技术， 即高通量测序技术， 具有通量大、 时间短、 精确度高和信息量丰富等优点， 适 用于没有明确候选基因或候选基因数量较多的大样本病例筛查。 NGS对于有致病基因位点说　明　书 1/5 页 3 CN 114277125 A 3