(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210009887.5 (22)申请日 2022.01.06 (71)申请人 青海大学 地址 810000 青海省西宁市城北区宁大路 251号 (72)发明人 马玉花　冶贵生　王晨兆　张丹　 董佳伟　 (74)专利代理 机构 青海省专利服 务中心 6 3100 专利代理师 周同永 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 干旱胁迫下沙棘不同组织的荧光定量PCR内 参基因及其筛 选方法和应用 (57)摘要 本发明涉及生物 技术领域， 具体涉及干旱胁 迫下沙棘不同组织的荧光定量PCR内参基因及其 筛选方法和应用， 通过对培育的沙棘苗进行了干 旱胁迫， 选择5个梯度干旱胁迫下的沙棘不同组 织器官， 采用实时荧光定量PCR技术检测沙棘转 录组数据库中22个候选内参基因在不同胁迫程 度下不同组织部位的表达情况， 然后用软件对内 参基因的表达稳定性进行评价得出干旱胁迫下 沙棘不同组织器官中相对最稳定的内参基因。 本 发明筛选出在干旱胁迫条件下在沙棘根中相对 稳定表达的内参基因为TATA； 茎中为RPL13 ‑2， UEP‑2和PEPC‑2； 叶中为HIS3 ‑2。 本发明为今后发 掘沙棘抗旱相关基因以及其功能的研究提供了 有效的稳定内参基因， 为沙棘抗旱差异表达基因 的筛选提供了有效的校正工具。 权利要求书2页 说明书9页 序列表6页 附图3页 CN 114480702 A 2022.05.13 CN 114480702 A 1.干旱胁迫下沙棘不同组织的荧光定量PCR内参基因， 其特征在于， 所述干旱胁迫下沙 棘不同组织的荧光定量P CR内参基因中， 根组织材料稳定内参基因为TATA； 茎组织材料稳定 内参基因为RPL13 ‑2， UEP‑2和PEPC‑2； 叶组织材料稳定内参基因为HIS3 ‑2； 所述内参基因 TATA的序列号如SEQ  ID.NO.1所示； 所述内参基因RPL13 ‑2的序列号如SEQ  ID.NO.2所示； 所 述内参基因UEP ‑2的序列号如SEQ  ID.NO.3所示； 所述内参基因PEPC ‑2的序列号如SEQ   ID.NO.4所示； 所述内参基因HIS3 ‑2的序列号如SEQ  ID.NO.5所示。 2.根据权利要求1所述的干旱胁迫下沙棘不同组织的荧光定量PCR内参基因的专用引 物， 其特征在于， 所述内参基因TATA的引物序列是： F： 5’ ‑AAGTTGGCAGCACGA AAGTATG‑3’； R： 5’ ‑GGGGAATTTAACATCACA AGAACC‑3’； 所述内参基因RPL13 ‑2的引物序列是： F： 5’ ‑TGGTGGACTTGTTAGGCAGAAA‑3’； R： 5’ ‑TAGCAGGAGCCCGAAAGTG‑3’； 所述内参基因UEP ‑2的引物序列是： F： 5’ ‑GGCTTCGTGGAGGTATTATTGAAC‑3’； R： 5’ ‑GGGTGAAGACGAGCATAGCA ‑3’； 所述内参基因PEPC ‑2的引物序列是： F： 5’ ‑GTCGTCCATCAAAACGCAAG‑3’； R： 5’ ‑AAGCCAAGCCACACAGGTAAA‑3’； 所述内参基因HIS3 ‑2的引物序列是： F： 5’ ‑CCGTAAATCAGCCCCAACC‑3’； R： 5’ ‑GAACAAGCCTCTGGAATGGAA‑3’。 3.根据权利要求1所述的干旱胁迫下沙棘不同组织的荧光定量PCR内参基因 的应用， 其 特征在于， 所述干旱胁迫下沙棘不同组织的荧光定量PCR 内参基因在沙棘荧光定量P CR中应 用。 4.根据权利要求2所述的干旱胁迫下沙棘不同组织的荧光定量PCR内参基因的专用引 物的应用， 其特 征在于， 所述的专用引物在沙棘 荧光定量PCR中应用。 5.干旱胁迫下沙棘不同组织的荧光定量PCR内参基因 的筛选方法， 其特征在于， 具体步 骤包括如下： 步骤1， 材料的获取： 采集野生 中国沙棘种子， 将种子播于花盆 中， 待苗木长至15～20cm 时将苗木随机 分组， 进行干旱胁迫处理， 其中干旱胁 迫处理中对照组正常浇水； 干旱胁迫处 理组停止浇水， 分别在干旱胁迫的3天， 6天， 9天时， 收集沙棘苗样 本， 第9天沙棘苗萎蔫后开 始复水， 并在复水2 4h后采样， 分别采集对照、 干旱胁 迫和复水 处理的沙棘的根、 茎、 叶， 用超 纯水清洗并用滤纸吸干表面水分后立即放入冻存管中， 不同组织部位的每个样本重复采集 三次， 将采集后的样本装袋编号， 用液氮速冻后放入 ‑80℃超低温冰箱中保存， 备用； 步骤2， 沙棘不同组织RNA提取及cDNA模板准备： 沙棘根、 茎、 叶在液氮中分别研磨成细 粉， 使用植物RNA快速提取试剂盒提取沙棘根、 茎、 叶中总RNA， ‑80℃冰箱中保存 备用； 1％琼 脂糖凝胶电泳检测总RNA完整性； 取1 μL检测样品， 用微量核酸蛋白测定仪检测OD260/28 0值权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114480702 A 2和RNA浓度， 测值介于1.9 ‑2.1且单峰度为合格样品； 使用 II 1st Strand  cDNA Synthesis Kit试剂盒进行沙棘总RNA反转录， 将得到的反转录产物置于 ‑20℃的冰箱 中保存； 步骤3， 选取候选内参基因， 合成PCR扩增引物： 根据沙棘转录组测序技术获得沙棘中相 对稳定表达的内参候选基因的核普酸序列， 经过序列分析以及与NCBI数据库Blast比对， 确 定22个基因序列为沙棘内参候选基因的序列， 随后又基于此序列设计合成荧光定量PCR扩 增引物； 步骤4， 将步骤2所获得的沙棘 根、 茎、 叶的cDNA产物进行实时荧 光定量PCR分析； 步骤5， 稳定内参基因筛选： 将实时荧光定量Ct值输入到分析软件NormFinder进行内参 基因稳定性分析， 确立表达最稳定的内参基因。 6.根据权利要求5所述的干旱胁迫下沙棘不同组织的荧光定量PCR内参基因的筛选方 法， 其特征在于， 所述步骤4的荧光定量PCR扩增反应体系为： 95℃预变性30s； 95℃变性 5sec； 按照步骤3所述的22个候选内参基因的荧光定量PCR扩增引物对应的退火温度49～60 ℃下退火30s， 72℃延伸3 0s， 40～45个 循环。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114480702 A 3