(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210010054.0 (22)申请日 2022.01.06 (71)申请人 山西大学 地址 030006 山西省太原市坞城路9 2号 (72)发明人 李建国　高泽峰　杨友　袁悉梅　 吴长新　 (74)专利代理 机构 太原申立德知识产权代理事 务所(特殊普通 合伙) 14115 代理人 张向莹 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 一种鉴定新型冠状病毒Lambda变异株的 qRT-PCR方法 (57)摘要 本发明属于生物 技术领域， 具体涉及一种鉴 定新型冠状病毒Lambda变异株的qRT ‑PCR方法。 本方法为提升检测灵敏度和特异性， 引入TaqMan 探针； 为降低成本， 将2对引物改为1对半引物， 即： 2条上游引物分别靶向突变位点和原始未变 异位点， 1条下游引物为2条上游引物共用。 为增 强变异检测的灵敏度， 在上游 突变引物变异位点 5’方向第3个位点引入突变， 通过降低反应体系 中变异引物与未变异病毒核酸和未变异引物与 变异病毒核酸的匹配度， 造成反应体系中变异引 物扩增变异病毒核酸的扩增曲线早于扩增非变 异核酸的扩增曲线， 同理， 非变异引物扩增非变 异核酸的扩增曲线早于扩增变异核酸的扩增曲 线。 权利要求书2页 说明书8页 序列表5页 附图4页 CN 114277194 A 2022.04.05 CN 114277194 A 1.一种鉴定新型 冠状病毒Lambda变异株的qRT ‑PCR方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： 步骤1， 使用Trizo l法提取新冠病毒RNA； 步骤2， 基于ARMS的qRT ‑PCR引物探针设计： 步骤2.1， 引物设计： 按照引物设计通用原则， 结合新型冠状病毒印度变种的变异位点 附近核苷酸序列， 对每个变异位点设计两对引物， 其中上游引物3 ’端分别匹配变异和非变 异点， 即变异上游引物和非变异位上游引物， 两对上游引物共用一个下游引物； 当需要鉴别的变异位点为G75V时， 变异上游引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO.1所示： 5’ ‑CATGTCTCTGGGACCAACGT ‑3’， 非变异上游引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO.2所示： 5 ’ ‑ CATGTCTCTGGGACCAATGG ‑3’， 下游引物如SEQ  ID NO.3所示： 5 ’ ‑GTAGGGACTGGGTCTTCGAATC ‑ 3’； 当需要鉴别的变异位点为T76I时， 变异上游引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO.4所示： 5’ ‑CATGTCTCTGGGA CCAATGCTAT ‑3’， 非变异上游引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO.5所示： 5’ ‑ ATGTCTCTGGGACCAATGGTAC ‑3’， 下游 引物如SEQ  ID NO .6所示 ： 5 ’‑ GTAGGGACTGGGTCTTCGAATC‑3’； 当需要鉴别的变异位点为 △246‑252时， 变异上游引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO.7所 示： 5’ ‑CTTGCTTTACATGATTCTTCTTCAGGTTGG ‑3’， 非变异上游引物的核苷酸序列如SEQ  ID  NO.8所示： 5 ’ ‑TGCTTTACATAGAAGTTATTTGACTCCTGG ‑3’， 下游引物如SEQ  ID NO.9所示： 5 ’ ‑ GCACAGTCTACAGCATCTGTA ATGG‑3’； 当需要鉴别的变异位点为L452Q时， 变异上游引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO.10所示： 5’ ‑CTTGATTCTAAGGTTGGTGGTAATTATAATTAGCA ‑3’， 非变异上游引物的核苷酸序列如SEQ  ID  NO.11所示： 5 ’ ‑CTTGATTCTAAGGTTGGTGGTAATTATAATTACCT ‑3’， 下游引物如SEQ  ID NO.12所 示： 5’ ‑CCATTAGTGGGTTGGAAACCATATGAT TG‑3’； 当需要鉴别的变异位点为F490S时， 变异上游引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO.13所示： 5’ ‑CCTTGTAATGGTGTTGAAGGTTTTAATTGTTAGTC ‑3’， 非变异上游引物的核苷酸序列如SEQ  ID  NO.14所示： 5 ’ ‑CCTTGTAATGGTGTTGAAGGTTTTAATTGTTACTT ‑3’， 下游引物如SEQ  ID NO.15所 示： 5’ ‑AACCAAATTAGTAGACT TTTTAGGTCCACAAACAG‑3’； 当需要鉴别的变异位点为D614G时， 变异上游引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO.16所示： 5’ ‑TAACCAGGTTGCTGTTCTTTATCATGG ‑3’， 非变异上游引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO.17所 示： 5’ ‑TAACCAGGTTGCTGTTCTTTATCAGGA ‑3’， 下游引物如SEQ  ID NO.18所示： 5 ’ ‑ TGCACCAATGGGTATGTCACACTC ‑3’； 当需要鉴别的变异位点为T859N时， 变异上游引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO.19所示： 5’ ‑GTGCACAAAAGTTTAA CGGCCTGAA ‑3’， 非变异上游引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO.20所示： 5’‑GTGCACAAAAGTTTAACGGCCTTAC ‑3’， 下游引物如SEQ  ID NO .21所示： 5 ’‑ TATTTGTAATGCAGCAC CTGCACC‑3’； 步骤2.2， TaqMan探针设计： 按照TaqMan探针设计通用原则， 结合步骤2.1中上下游引物 所限定病毒基因组区域序列特点设计TaqMan探针， 每个变异位点的两对引物共用一条 TaqMan探针； 当需要鉴别的变异位点为G75V时， TaqMan探针的核苷酸序列如SEQ  ID NO.22所示： 5 ’ ‑ CTAAGAGGTTTGATAACCCTGTCCTACCATTTAATGATGGTG‑3’；权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114277194 A 2当需要鉴别的变异位点为T76I时， TaqMan探针的核苷酸序列如SEQ  ID NO.23所示： 5 ’ ‑ TAAGAGGTTTGATAACCCTGTCCTACCATTTAATGATGGTG‑3’； 当需要鉴别的变异位点为 △246‑252时， TaqMan探针的核苷酸序列如SEQ  ID NO.24所 示： 5’ ‑CAGCTGGTGCTGCAGCT TATTATGTGGGTTATC‑3’； 当需要鉴别的变异位点为L452Q时， TaqMan探针的核苷酸序列如SEQ  ID NO.25所示： 5’ ‑CTATCAGGCCGGTAGCACAC CTTGTAATGGTGTTGAAGG‑3’； 当需要鉴别的变异位点为F490S时， TaqMan探针的核苷酸序列如SEQ  ID NO.26所示： 5’ ‑CCAACCCACTAATGGTGTTGGTTACCAACCATACAGAG ‑3’； 当需要鉴别的变异位点为D614G时， TaqMan探针的核苷酸序列如SEQ  ID NO.27所示： 5’ ‑ACTGCACAGA AGTCCCTGTTGCTATTCATGCAGATC ‑3’； 当需要鉴别的变异位点为T859N时， TaqMan探针的核苷酸序列如SEQ  ID NO.28所示： 5’ ‑CTGTTTTGCCACCTTTGCTCACAGATGA AATGATTGC‑3’； 步骤3， 基于ARMS进行qRT ‑PCR实验； 步骤4， 结果判读： 步骤4.1， 变异引物体系的扩增曲线出现时间早于非变异引物体系2个循环以上， 判定 检测样品中发生变异； 步骤4.2， 非变异引物体系的扩增曲线出现时间早于变异引物体系2个循环以上， 判定 检测样品中未发生变异。 2.根据权利 要求1所述的一种鉴定新型冠状病毒L ambda变异株的qRT ‑PCR方法， 其特征 在于， 所述 步骤3中基于ARMS进行qRT ‑PCR实验， 具体步骤为： 步骤3.1， 配制反应体系： 每个反应体系体积为20 μL， 其中含2X反应液10 μL， 50 μM上游引 物0.2 μL， 50 μM 下游引物 0.2 μL， 50 μM  TaqMan探针0.1 μL， 无菌 无RNase水7.5 μL， RNA模板2 μL， 每个变异位点的检测由两个反应体系构成， 一个含变异上游引物， 另一个含非变异下游引 物， 其他上述成分相同； 步骤3.2， qRT ‑PCR反应条件： 在荧光定量PCR仪上执行以下反应程序： 95℃， 3分钟； 45个 循环的95℃， 15秒 ‑60℃， 30秒。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114277194 A 3