(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210015915.4 (22)申请日 2022.01.07 (71)申请人 东南大学 地址 210096 江苏省南京市玄武区新 街口 街道四牌楼 2号 (72)发明人 范小波　吴国球　 (74)专利代理 机构 北京同辉知识产权代理事务 所(普通合伙) 11357 代理人 赵丹 (51)Int.Cl. C12Q 1/682(2018.01) C12Q 1/70(2006.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 一种无酶催化的核酸自组装逻辑环路及其 应用 (57)摘要 本发明公开一种无酶催化的核酸自组装逻 辑环路及其应用， 由3条自组装发卡链和1条催化 起始链混合杂交形成， 反应起始时， A链和B链杂 交启动自组装； B 链和A链杂交后形成游离 单链暴 露出与C链、 D链结合的区域， 并与C链和D链杂交 再次形成游离的核酸单链， 游离的核酸单链可与 B链再次杂交； 杂交后的B链游离序列可再次与C 链、 D链杂交， 由此形成一个闭合的超支化的自我 催化逻辑环路， 操作 简单， 成本低廉， 显著提高了 核酸的自组装的效率， 可应用于临床核酸检测及 相关领域。 权利要求书1页 说明书3页 序列表1页 附图3页 CN 114369642 A 2022.04.19 CN 114369642 A 1.一种无酶催化的核酸自组装逻辑环路， 其特征在于， 由3条自组装发卡链和1条催化 起始链混合杂交形成； 所述自组装发卡链包括B链、 C链和D链； 催化 起始链为A链； 所述A链的序列为： 5 ’ ‑AAACUUCCGAACGGUCCCAGCAU‑3’。 2.根据权利要求1所述的一种无酶催化的核酸自组装逻辑环路， 其特征在于， 反应起 始： A链和B链杂交启动自组装； B链和A链杂交后形成游离单链暴露出与C链、 D链结合的区 域， 并与C链和D链杂交再次形成游离的核酸单链， 游离的核酸单链可与B链再次杂交； 杂交 后的B链游离序列可再次与C链、 D链杂交， 由此形成一个闭合的超支化的自我催化逻辑环 路。 3.根据权利要求1或2所述的一种无酶催化的核酸自组装逻辑环路， 其特征在于， 所述A 链由c’ ‑d’ ‑p’结构域组成。 4.根据权利要求1或2所述的一种无酶催化的核酸自组装逻辑环路， 其特 征在于， 所述 所述B链由d ’ ‑a’ ‑b’ ‑m1‑m2‑b‑a‑p‑d‑c‑n1‑n2‑c’ ‑d’ ‑a’结构域组成； 所述C链由m1 ‑b‑a‑d‑n1’ ‑c’ ‑d’ ‑p’ ‑a’ ‑b’ ‑m2’结构域组成； 所述D链由n1 ’ ‑c’ ‑d’ ‑p’ ‑a’ ‑b’ ‑m2’ ‑a‑d‑c‑n2’结构域组成； A链、 B链、 C链和D链的核酸序列 均按5‘→3’排列顺序。 5.根据权利要求4所述的一种无酶催化的核酸自组装逻辑环路， 其特征在于， 核酸序列 组成： a和a ’互补， b和b ’互补， c和c ’互补， d和d ’互补， p和p ’互补， m1和m1 ’互补， m2和m2 ’互 补， n1和n1 ’互补， n2和n2 ’互补； b、 c、 m2和n1结构域序列长度均不多于10个核苷酸； a、 b、 c、 d、 p、 m1和n2结构域均含有5 ‑30个核苷酸； 以上序列除互补配对外， 各序列之间连续配对残 基少于3个。 6.根据权利要求4所述的一种无酶催化的核酸自组装逻辑环路， 其特征在于， 所述结构 域之间可以随机插 入1‑3个核苷酸。 7.根据权利要求1 ‑2任意一项所述的逻辑环路的应用， 其特征在于， 逻辑环路应用于临 床单链核酸的检测。 8.根据权利要求1 ‑2任意一项所述的逻辑环路的应用， 其特征在于， 逻辑环路用于DNA 单链、 RNA单链以及环状单链DNA和RNA的检测。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114369642 A 2一种无酶催化的核酸 自组装逻 辑环路及其应用 技术领域 [0001]本发明涉及核酸检测领域， 具体是一种无酶催化的核酸自组装逻辑环路及其应 用。 背景技术 [0002]无酶核酸等温自组装技术由于其无需酶参与， 操作简单， 成本低廉， 在核酸检测领 域具有巨大的应用潜力。 已有的报道中， 无酶核酸自组装技术大量应用于细菌、 病毒、 支原 体、 衣原体、 人和动物来源的核酸的检测分析， 但是相较于传统的PCR/分子杂交技术， 无酶 核酸自组装技术反应效率不高， 反应不彻底， 信号扩增倍数有限导致其检测性能低下。 超支 化的非线性组装/扩增技术方案的设计能显著提高核酸反应的速率和效率， 可以显著提高 信号扩增 倍数， 极大提高无酶核酸自组装技术的检测 性能。 目前已有的超支化的非线性组 装/扩增技术方案仅有数种， 且设计复杂， 含有5条以上的反应链， 增加了反应的背景干扰； 在原理上反应也并不彻底， 对信号的扩增提高有限。 发明内容 [0003]本发明的目的在于提供一种无酶催化的核酸自组装逻辑环 路及其应用， 解决了上 述技术问题， 无酶核酸自组装逻辑环路具有反应速率快， 耗时短， 反应彻底， 信号扩增倍数 高， 灵敏度高的优势； 无需昂贵的实时荧光定量PCR仪或者测序仪， 通过简单的恒温设备即 可使其反应进行； 反应体系无需酶促， 试剂盒成本低廉， 且省去了相应的存储、 运输过程中 的冷链成本 。 [0004]本发明的目的可以通过以下技 术方案实现： [0005]一种无酶催化的核酸自组装逻辑环 路， 由3条自组装发卡链和1条催化起始链混合 杂交形成； [0006]所述自组装发卡链包括B链、 C链和D链； 催化 起始链为A链； [0007]所述A链的序列为： 5 ’ ‑AAACUUCCGAACGGUCCCAGCAU‑3’。 [0008]进一步地， 反应起始： A链和B链杂交启动自组装； B链和A链杂交后形成游离单链暴 露出与C链、 D链结合的区域， 并与C链和D链杂交再次形成游离的核酸单链， 游离的核酸单链 可与B链再次杂交； 杂交后的B链游离序列可再次与C链、 D链杂交， 由此形成一个闭合的超支 化的自我催化逻辑环路。 [0009]进一步地， 所述B链是由d ’ ‑a’ ‑b’ ‑m1‑m2‑b‑a‑p‑d‑c‑n1‑n2‑c’ ‑d’ ‑a’结构域组 成。 [0010]所述C链由m1 ‑b‑a‑d‑n1’ ‑c’ ‑d’ ‑p’ ‑a’ ‑b’ ‑m2’结构域组成。 [0011]所述D链由n1 ’ ‑c’ ‑d’ ‑p’ ‑a’ ‑b’ ‑m2’ ‑a‑d‑c‑n2’结构域组成。 [0012]A链、 B链、 C链和D链的核酸序列 均按5‘→3’排列顺序。 [0013]进一步地， 核酸序列组成： a和a ’互补， b和b ’互补， c和c ’互补， d和d ’互补， p和p ’互 补， m1和m1 ’互补， m2和m2 ’互补， n1和n1 ’互补， n2和n2 ’互补； b、 c、 m2和n1结构域序列长度均说　明　书 1/3 页 3 CN 114369642 A 3