(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210018642.9 (22)申请日 2022.01.08 (71)申请人 安徽医科 大学第一附属医院 地址 230000 安徽省合肥市蜀山区绩溪路 218号 (72)发明人 胡泽平　陈琦　冯静　陈伟　 朱学涛　 (74)专利代理 机构 合肥市浩智运专利代理事务 所(普通合伙) 34124 代理人 缪璐欢 (51)Int.Cl. C12Q 1/6804(2018.01) C12N 15/11(2006.01) G01N 33/68(2006.01) G01N 33/543(2006.01)G01N 33/558(2006.01) G01N 33/58(2006.01) (54)发明名称 一种肝细胞生长因子检测及信号增敏探针、 引物对及其应用 (57)摘要 本发明公开一种肝细胞生长因子检测及信 号增敏探针， 涉及肝细胞生长因子检测技术领 域， 所述探针5 ’端标修饰了荧光素(FITC)， 所述 探针的序列如SEQ  ID NO.1所示。 本发明还提供 采用酶促重组等温扩增法扩增上述探针的引物 对及其应用。 本发明的有益效果在于： 利用夹心 法间接捕获目标探针， 并且将酶促重组等温扩增 技术(ERA)与侧向免疫层析技术相结合放大检测 信号， 从而提高检测灵敏度。 权利要求书2页 说明书10页 附图1页 CN 114292899 A 2022.04.08 CN 114292899 A 1.一种肝细胞生长因子检测及信号增敏探针， 其特征在于： 所述探针的5 ’端标修饰了 FITC， 所述探针的序列如SEQ  ID NO.1所示。 2.采用酶促重组等温扩增法扩增权利要求1中所述的探针的引物对， 其特征在于： 所述 引物对包括FITC修饰的上游引物和生物素修饰的下游引物， 所述上游引物和下游引物的序 列分别如SEQ  ID NO.2和SEQ  ID NO.3所示。 3.一种采用权利要求1所述的探针捕 获待测物中肝细胞生长因子的方法， 其特征在于： 包括以下步骤： (1)将FITC抗体、 HGF抗体1和胶体金偶联， 制得FITC抗体与HGF抗体1标记的胶体金溶 液； (2)将权利要求1所述的检测探针与步骤(1)标记两种抗体的胶体金上的FITC抗体结 合； (3)将HGF抗体2与羧基化的磁性纳米粒子偶联， 制得HGF抗体2标记的磁性纳米粒子； (4)将步骤(2)中权利 要求1所述的探针的胶体金溶液与HGF抗体2标记的磁性纳米粒子 溶液混合； (5)将待检物加入步骤(4)的混合物中， 充分结合后， 磁性分离， 洗涤后， 定量目标物HGF 的含量间接转换为定量FITC修饰的目标探针。 4.根据权利要求3所述的探针捕获肝细胞生长因子的方法， 其特征在于： 所述步骤(1) 具体包括以下步骤： (a)调节pH： 用K2CO3调节胶体金 溶液的pH至偶联的两种抗体的等电点偏高处； (b)偶联： 分别加入适 量的FITC抗体和HGF抗体1， 室温孵 育1～2h； (c)封闭： 加封闭剂BSA溶液， 室温封闭0.5～1h， 离心， 去上清， 复溶， 制得FITC抗体与 HGF抗体1标记的胶体金 溶液。 5.根据权利要求3所述的探针捕获肝细胞生长因子的方法， 其特征在于： 所述步骤(2) 具体包括以下步骤： 取适量步骤(1)中标记两种抗体的胶体金， 向其中加入过量的探针， 充 分混合后静置一段时间， 然后用缓冲溶 液将混合物进行洗涤。 6.根据权利要求3所述的探针捕获肝细胞生长因子的方法， 其特征在于： 所述步骤(3) 具体包括以下步骤： (a)活化： 往适量浓度的磁性纳米粒子溶液加入1 ‑(3‑二甲氨基丙基) ‑3‑乙基碳二亚胺 盐酸盐和N ‑羟基琥珀酰 亚胺的水 溶液， 室温避光活化15～6 0min； (b)偶联： 磁性分离， 去上清， 洗涤后， 加入1 ×PBS缓冲液重悬， 加入适量的HGF抗体2， 室 温孵育2～3h； (c)封闭： 加入封闭剂BSA溶 液， 室温封闭0.5～1h； (d)重悬： 磁性分离， 去上清， 洗涤后， 加入质量体积比为0.5～1.5％BSA的1 ×PBS复溶， 冷藏保藏。 7.根据权利要求6所述的探针捕 获肝细胞生长因子的方法， 其特征在于： 所述磁性纳米 粒子表面羧基、 1 ‑(3‑二甲氨基丙基) ‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐和N ‑羟基琥珀酰亚胺的摩尔 比为1： 5： 5～1： 20： 20， 所述磁性纳米粒子的浓度为20～50mg/mL， 所述HGF抗体2的浓度为 1mg/mL， 所述封闭剂BSA溶 液的质量体积比为10％～ 20％。 8.一种采用权利要求2所述的引物对扩增捕获细胞生长因子检测及信号增敏探针的方权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114292899 A 2法， 其特征在于： 包括以下步骤： (1)将FITC抗体、 HGF抗体1和胶体金偶联， 制得FITC抗体与HGF抗体1标记的胶体金溶 液； (2)将探针与步骤(1)标记两种抗体的胶体金上的FITC抗体结合； 所述探针的5 ’端标修 饰了FITC， 所述探针的序列如SEQ  ID NO.1所示； (3)将HGF抗体2与羧基化的磁性纳米粒子偶联， 制得HGF抗体2标记的磁性纳米粒子； (4)将结合探针的胶体金 溶液与HGF抗体2标记的磁性纳米粒子溶 液混合； (5)将待检物加入步骤(4)的混合物中， 充分结合后， 磁性分离， 洗涤后， 用水复溶得到 重悬液； (6)将ERA检测试剂与权利 要求2中的上游引物和下游引物混合， 加入步骤(5)中的重悬 液， 然后加入激活剂反应。 9.一种采用侧向免疫层析试纸条检测肝细胞生长因子的方法， 其特征在于： 包括以下 步骤： (1)所述侧向免疫层析试纸条包括支撑板， 所述支撑板沿其轴线方向依次设置上样区、 结合FITC抗体的抗体金的标记区、 划线 区和吸水区， 所述上样区、 标记区、 划线 区和吸水区 上依次对应粘贴样品垫、 标记垫、 纤维素膜以及吸水垫； 所述划线区内设有检测线T和质控 线C， 且所述检测线 T和质控线C分别结合有链霉亲和素和二 抗； (2)采用权利要求8所述的引物对扩增捕获了细胞生长因子检测及信号增敏探针的方 法， 将扩增得到的产物上样于试纸条 的上样区， 根据检测线的显色结果对肝细胞生长因子 进行定性或定量检测。 10.根据权利要求9所述的采用侧向免疫层析试纸条检测肝细胞生长因子的方法， 其特 征在于： 所述侧向免疫层析试纸条的制备方法包括以下步骤： 将FITC抗体与胶体金偶联， 制 得FITC抗体标记的胶体金将链霉亲和素和羊抗鼠二抗分别制成划线区的检测线T以及质控 线C； 以及将上样区、 标记区、 划线区和吸水区沿设定方向依次设置在支撑板上， 获得所述的 侧向免疫层析 试纸条。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114292899 A 3