(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210019849.8 (22)申请日 2022.01.10 (71)申请人 华智生物技 术有限公司 地址 410000 湖南省长 沙市芙蓉区合平路 618号 (72)发明人 易丽媛　曹桂元　田冰川　许美娟　 唐顺学　 (74)专利代理 机构 广州嘉权专利商标事务所有 限公司 4 4205 代理人 马俊 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 一种桃拉病毒的检测方法及其检测试剂盒 (57)摘要 本发明公开了一种桃拉病毒的检测方法及 其检测试剂盒， 涉及分子生物学技术领域。 本发 明的用于检测桃拉病毒的引物包括Taura ‑F和 Taura‑R； 所述Taura ‑F的序列如SEQ  ID NO.1所 示； Taura ‑R的序列如SEQ  ID NO.2所示。 该组引 物有灵敏度高和特异性强的特点， 可用于检测桃 拉病毒。 基于该组引物和Douglas  Array Tape平 台建立的检测方法操作简单， 灵敏度高， 特异性 强， 检测通量高， 检测速度快， 且成本低， 适用于 对虾桃拉病毒的监测、 诊断和早期预防。 权利要求书1页 说明书5页 序列表2页 附图3页 CN 114262756 A 2022.04.01 CN 114262756 A 1.一组检测桃拉病毒的引物， 其特 征在于， 包括： Taura ‑F和Taura ‑R； 所述Taura ‑F的序列如SEQ  ID NO.1所示； Taura‑R的序列如SEQ  ID NO.2所示。 2.一种检测桃拉病毒的试剂盒， 其特 征在于， 包括权利要求1所述的引物。 3.权利要求1所述的引物在制备桃拉病毒检测产品中的应用。 4.根据权利要求3所述的应用， 其特征在于， 所述桃 拉病毒检测产品还包括用于检测内 参基因的上游引物IC ‑F和下游引物IC ‑R。 5.根据权利要求 4所述的应用， 其特 征在于， 所述内参基因为对虾GAD PH基因； 所述上游引物IC ‑F的序列如SEQ  ID NO.4所示； 所述下游引物IC ‑R的序列如SEQ  ID NO.5所示。 6.根据权利要求4或5所述的应用， 其特征在于， 所述桃拉病毒检测产品的使用方法为： 采用桃拉病毒检测产品对样品的RNA进行 KASP反应检测， 分析检测数据， 得到分析 结果。 7.根据权利要求6所述的应用， 其特征在于， Taura ‑F和IC‑F分别连接不 同的荧光接头 序列。 8.根据权利要求7所述的应用， 其特征在于， 所述荧光接头序列选自FAM荧光接头序列 和HEX荧光接头序列。 9.根据权利要求6 ‑8任一项所述的应用， 其特征在于， 所述检测数据的分析方法为： 若 只检测到IC‑F所连荧光接头序列对应的荧光信号， 则判断样品不含桃拉病毒； 若同时检测 到Taura‑F和IC‑F所连荧光接头序列对应的荧光信号， 则判断样品含桃拉病毒； 若同时未检 测到Taura ‑F和IC‑F所连荧光接头序列对应的荧光信号， 则判断样品RNA 提取失败或扩增失 败。 10.根据权利 要求6‑9任一项所述的应用， 其特征在于， 所述KASP反应的扩增程序为： 50 ℃30min； 94℃5min； 94℃2 0s， 65℃‑57℃60s， 10个循环， 每个循环降低0.8℃； 94℃2 0s， 57℃ 60s， 50个循环。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114262756 A 2一种桃拉病毒 的检测方 法及其检测试剂盒 技术领域 [0001]本发明涉及分子生物学技术领域， 特别涉及一种桃拉病毒的检测方法及其检测试 剂盒。 背景技术 [0002]病毒感染流行和传 播是对虾养殖过程中最大的威胁之一， 每年因虾病造成的经济 损失巨大， 严重影响水产行业的发展。 桃拉病毒(Taura  syndrome  virus， TSV)是一种无囊 膜的单股正链RNA病毒， 属于小RNA病毒家族， 电镜下呈对称的二十面体结构， 直径31 ‑32nm， 在宿主细胞胞浆中复制。 桃拉病毒于1992年在厄瓜多尔首次被检出， 此后在世界范围内虾 类养殖业中广泛传播； 感染后的南美白对虾死亡率高达73％以上， 感染后存活的对虾是无 症状的慢性感染病毒携带体， 目前尚无有效的防治方法， 因此在养殖生产过程对亲虾和种 苗进行严格的检疫是十分必要的。 [0003]目前桃拉病毒的检测方法包括： 传统PC R方法、 荧光PCR、 环介导逆转录等温扩增技 术和CRISPR技术。 普通PCR检测法是许多对虾病原诊断的传统方法， PCR技术虽然结果准确， 但灵敏度不够， 操作流程耗时， 在一定程度上限制了普通PCR检测方法在生产中的推广应 用； 环介导等温扩增法， 虽然检测时间快、 操作简单， 但假阳性高， 一直受到专业人士的诟 病。 荧光PCR和CRISPR技术不仅迅速、 简便、 实用， 提高了检测灵敏度， 可以检测出潜在感染 和早期感染， 但是在实际样品检测工作中， 其通量不高， 检测成本较高， 实验依赖专业人力 操作， 导致其在应对大批量检测需求时存在效率低的问题。 [0004]因此， 开发一种能够高效、 灵敏检测对虾桃拉病毒的检测方法对于对虾的养殖与 疾病防控具有极为重要的意 义。 发明内容 [0005]本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。 为此， 本发明提出一组引 物和基于该组引物的检测方法， 具有灵敏度高和特异性强的特点， 检测范围为1 × 107copies/mL～ 2×102copies/mL， 可用于检测对虾样品是否感染桃拉病毒。 [0006]本发明的第一个方面， 提供一组检测桃拉病毒的引物， Taura ‑F和Taura ‑R； 所述 Taura‑F的序列如SEQ  ID NO.1所示； Taura ‑R的序列如SEQ  ID NO.2所示。 [0007]在本发明的一些实施方式 中， 所述Taura ‑F的一端连接有荧 光接头序列。 [0008]在本发明的一些实施方式 中， 所述Taura ‑F的5’端连接有荧 光接头序列。 [0009]在本发明的一些实施方式中， 所述荧光接头序列选自FAM荧光接头序列和HEX荧光 接头序列。 [0010]在本发明的一些实施方式中， 所述FAM荧光接头序列的核苷酸序列为： 5 ’‑ GAAGGTGACCAAGTTCATGCT‑3’。 [0011]在本发明的一些实施方式中， 所述HEX荧光接头序列的核苷酸序列为： 5 ’‑ GAAGGTCGGAGTCAACGGATT‑3’。说　明　书 1/5 页 3 CN 114262756 A 3