(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210023702.6 (22)申请日 2022.01.10 (71)申请人 中南大学湘雅三医院 地址 410023 湖南省长 沙市岳麓区桐梓坡 路138号 申请人 湖南大地同年 生物科技有限公司 (72)发明人 王龙　鞠巍　刘建业　李超　 徐根明　汤维　姚鲲　李永祥　 李仁君　 (74)专利代理 机构 长沙睿翔专利代理事务所 (普通合伙) 43237 代理人 周松华　孙建霞 (51)Int.Cl. C12Q 1/6886(2018.01) C12Q 1/686(2018.01)C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 用于尿路上皮癌靶基因拷贝数qPCR定量检 测的特异性引物、 探 针组合及应用 (57)摘要 本发明公开了用于尿路上皮癌靶基因拷贝 数qPCR定量检测的特异性引物、 探针组合及应 用。 本发明利用多重实时荧光定量PCR法， 检测尿 沉淀DNA中与尿路上皮癌相关的CDKN2A、 NUMA1、 FOSL2、 BECN1四个基因的扩增Ct值， 以CFTR1和 POP1两个基因作为内参， 采用2‑Δ Δ Ct法(Livak 法)， 分别计算四个基因的拷贝数。 并利用50例尿 路上皮癌患者和30例正常人的尿沉淀DNA， 建立 尿路上皮癌辅助诊断的预测模型。 权利要求书2页 说明书16页 序列表3页 附图2页 CN 114231636 A 2022.03.25 CN 114231636 A 1.用于尿路上皮癌靶基因拷贝数qPCR定量检测的特异性引物、 探针组合， 其特征在于， 包括： (1)CDKN2 A基因的特异性引物及探针： 正向引物： 5 ’ ‑TCCCAGTCTGCAGT TAAGGG‑3’， 如SEQ ID NO.1所示； 反向引物： 5 ’ ‑GGAGGGTCACCAAGAACCTG‑3’， 如SEQ ID NO.2所示； 探针： 5’ ‑CCTCTGGTGCCAAAGGGCGG‑3’， 如SEQ ID NO.3所示； (2)NUMA1基因的特异性引物及探针： 正向引物： 5 ’ ‑AAGACTGAAATCCTAACAGGGCAG‑3’， 如SEQ ID NO.4所示； 反向引物： 5 ’ ‑CAGGTCAACGGGGTGAGTCAG ‑3’， 如SEQ ID NO.5所示； 探针： 5’ ‑GTGTGGGTGTGGCTTGGCAGT‑3’， 如SEQ ID NO.6所示； (3)FOSL2基因的特异性引物及探针： 正向引物： 5 ’ ‑CCTGGAGGGAAGTCAGAC CG‑3’， 如SEQ ID NO.7所示； 反向引物： 5 ’ ‑TTCCTAGCACTG GTTTCCTGTC‑3’， 如SEQ ID NO.8所示； 探针： 5’ ‑CCCAGGATGTGAGCG GAGGC‑3’， 如SEQ ID NO.9所示； (4)BECN1基因的特异性引物及探针： 正向引物： 5 ’ ‑AGGTGAGGGTGGTGATGAGA ‑3’， 如SEQ ID NO.10所示； 反向引物： 5 ’ ‑CTGGGTCTCTCCTGGTTTCG‑3’， 如SEQ ID NO.11所示； 探针： 5’ ‑CCCATACTTTCAGATGC CCTCCTGC‑3’， 如SEQ ID NO.12所示。 2.根据权利要求1所述的特异性引物、 探针组合， 其特征在于， CDKN2A基因、 NUMA1基因、 FOSL2基因、 BE CN1基因的探针5端修饰FAM荧 光基团， 3端修饰MGB淬灭基团。 3.根据权利要求1所述的特异性引物、 探针组合， 其特征在于， 所述组合还包括内参基 因CFTR1基因的特异性引物及探针： 正向引物： 5 ’ ‑ACAGGTGTAGCCTGTAAGAG‑3’， 如SEQ ID NO.13所示； 反向引物： 5 ’ ‑CTTTCCTCAAAATTGGTCTGGT‑3’， 如SEQ ID NO.14所示； 探针： 5’ ‑TCCAAATCTGTATG GAGACCAAATC‑3’， 如SEQ ID NO.15所示。 4.根据权利要求1所述的特异性引物、 探针组合， 其特征在于， 所述组合还包括内参基 因POP1基因的特异性引物及探针序列： 正向引物： 5 ’ ‑GGTCAATGTTGCCACCCAAC‑3’， 如SEQ ID NO.16所示； 反向引物： 5 ’ ‑GGTCAATGTTGCCACCCAAC‑3’， 如SEQ ID NO.17所示； 探针： 5’ ‑TCCTGGAACTTCACGACAGCG G‑3’， 如SEQ ID NO.18所示。 5.权利要求1～4任一项所述特异性引物、 探针组合在制备用于尿路上皮癌qPCR定量检 测的试剂盒中的应用。 6.用于尿路上皮癌qPCR定量检测的试剂盒， 其特征在于， 包含权利要求1～4中任一项 所述特异性引物、 探针组合。 7.根据权利 要求6所述的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒包含CDKN2A反应液、 NUMA1反 应液、 FOSL2反应液、 BE CN1反应液、 主反应混合液、 阴性 参考品、 阳性 参考品和空白对照品。 8.根据权利要求7所述的试剂盒， 其特征在于， CD KN2A、 NUMA1、 FOSL2、 BECN1四个基因的 反应液中， 正向引物、 反向引物浓度均为0.1～100 μM， 更进一步优选为20 μM； 探针的浓度均 为0.01～20 μM， 更进一步优选为5 μM； 内参基因CFTR1和内参基因POP1两个基因正向引物、 反权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114231636 A 2向引物浓度均为0.05～50 μM， 更进一步优选为5 μM； 内参基因探针的浓度均为0.01～10 μM， 更进一步优选为1 μM 。 9.根据权利要求7所述的试剂盒， 其特征在于， 所述主反应混合液包含热启动Taq聚合 酶、 UDG酶、 PCR反应缓冲溶 液、 dNTPs/dU TP、 Mg2+、 ROX荧光参比染料。 10.用于辅助诊断或早筛 尿路上皮癌的预测模型， 其特 征在于， 如公式 Ⅰ所示： K＝0.4*2ΔΔCt(CDKN2A)+0.1*2‑ΔΔCt(NUMA1)+0.3*2‑ΔΔCt(FOSL2)+0.2 *2‑ΔΔCt(BECN1)(公 式Ⅰ)； 其中， K为模型检验分值， 2ΔΔCt(CDKN2A)、 2‑ΔΔCt(NUMA1)、 2‑ΔΔCt(FOSL2)、 2‑ΔΔCt(BECN1) 分别表示CDKN2A基因、 NUMA1基因、 FOSL2基因、 BECN1基因采用 △△Ct值法相对定量方式计 算得到的2‑Δ ΔCt值的倒数。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114231636 A 3