(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210026254.5 (22)申请日 2022.01.11 (71)申请人 湖南大学 地址 410082 湖南省长 沙市麓山 南路1号 (72)发明人 何凤姣　梁姿　 (74)专利代理 机构 北京睿智保诚专利代理事务 所(普通合伙) 11732 代理人 周新楣 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/385(2006.01) (54)发明名称 一种细菌种的16S rRNA基因特异性检测靶 标片段的筛 选方法及其应用 (57)摘要 本发明提供了一种细菌种的16S  rRNA基因 特异性检测靶 标片段的筛选方法及其应用， 属于 微生物检测技术领域。 本发明提供的筛选方法， 包括筛选候选靶标片段和验证候选靶标片段两 部分构成。 按照本发明的筛选方法得到的细菌种 的16S rRNA基因特异性检测靶标片段能够满足 “种内普适性 ”、“种间特异性和菌外特异性 ”要 求。 权利要求书1页 说明书10页 序列表7页 附图4页 CN 114317792 A 2022.04.12 CN 114317792 A 1.一种细菌种的16S  rRNA基因特异性检测靶标片段的筛选方法， 其特征在于， 包括如 下步骤： (1)获取目标细菌所在属的全部16S  rRNA全长序列； (2)对步骤(1)获得的全部16S  rRNA全长序列进行比对， 在全部16S  rRNA全长序列中， 筛选共有率低于25％的碱基序列， 并在共有率低于25％的碱基序列中选择2个bp以上的碱 基序列， 作为靶标碱基序列； (3)以靶标碱基序列为 中心， 从5'端第一个碱基向5'端方向延伸1～3个碱基， 从3'端第 一个碱基向3'端方向延伸至总碱基数为15～31bp， 得到候选靶标片段； (4)将步骤(3)得到的候选靶标片段在细菌16S  rRNA数据库、 真菌18S  rRNA数据库和人 类基因组数据库中进行比对， 得到仅指向目标菌的候选靶标片段； (5)对步骤(4)筛选得到的仅指向目标菌的候选靶标片段进行PCR扩增 ‑电泳验证和/或 压电传感器验证， 得到目标菌种的16S  rRNA基因特异性检测的靶标片段。 2.如权利要求1所述的筛选方法， 其特征在于， 步骤(3)中所述候选靶标片段不含有共 有率为100％的碱基序列， 所述共有率 为100％的碱基序列的序列长度大于等于7bp。 3.如权利要求2所述的筛选方法， 其特征在于， 步骤(4)中所述比对的参数均选为高度 相似序列。 4.如权利要求3所述的筛选方法， 其特征在于， 步骤(4)中得到的仅指向目标菌的候选 靶标片段的CG比为 40～60％， 长度为15～31bp， 二级结构中茎 部不超过 7个bp。 5.如权利要求4所述的筛选方法， 其特征在于， 所述PCR扩增 ‑电泳验证的方法为： 选择 只与目标菌的16S  rRNA基因序列结合的候选靶 标片段， 作为目标菌种的16S  rRNA基因特异 性检测的靶标片段。 6.如权利要求1～5任一项所述的筛选方法， 其特征在于， 所述压电传感器验证的方法 为： 选择能够在电极表面形成能够跨越电极的双链DNA产物， 所述双链DNA产物通过银染技 术金属化， 使压电传感器敏感响应的候选靶标片段， 作为目标菌种的16S  rRNA基因特异性 检测的靶标片段。 7.一种按照权利要求1～6任一项所述的筛选方法得到的铜绿假单胞菌种的16S  rRNA 基因特异性检测的靶标片段， 其特征在于， 所述铜绿假单胞菌种的16S  rRNA基因特异性检 测的靶标片段的核苷酸序列如SEQ  ID NO： 5、 SEQ ID NO： 10、 SEQ  ID NO： 15、 SEQ  ID NO： 20、 SEQ ID NO： 25、 SEQ  ID NO： 30、 SEQ ID NO： 35所示。 8.一种权利 要求7所述的铜绿假单胞菌种的16S  rRNA基因特异性检测靶标片段用于检 测铜绿假单 胞菌的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114317792 A 2一种细菌种的16S  rRNA基因特异性检测靶标片段的筛选方 法 及其应用 技术领域 [0001]本发明涉及微生物检测技术领域， 尤其涉及一种细 菌种的16S  rRNA基因特异性检 测靶标片段的筛 选方法及其应用。 背景技术 [0002]细菌广泛分布于人体和环境中， 与人类健康、 生产生活息息相关。 一些病原菌的存 在会威胁人类健康、 食品安全和医疗卫生， 因此细菌的快速检测， 对 人类社会的健康发展 具 有重要意 义。 [0003]细菌作为活体， 体积小、 数量多、 组成成分复杂， 检测难度大。 现有细菌检测需求 有： 总体细菌检测、 细菌 “属”、 细菌“种”的检测等。 现有细菌 “种”的检测技术， 存在检测周期 长、 对场所、 设备要求高， 不利于推广及大批量筛查问题。 不同于具体的化学物质， 细菌 “种” 的检测方法涉及到检测靶标的确定和靶标的检测方法两个方面。 目前用作细菌 “种”的检测 靶标包括菌体、 代谢产物、 蛋白质、 核酸 等。 [0004]菌体作为细菌 “种”的检测靶标， 需要取纯培养细菌， 存在检测灵敏度低、 时间长、 不利于检测难培养细菌的问题； 代谢产物作为细菌的检测靶标时， 同样存在检测周期长的 问题， 且由于代谢产物的产生受营养环境、 温度、 pH等环境因素的影响较大， 会导致检测结 果不够准确； 蛋白质靶标是特定基因的表达产物， 存在丰度低、 易受外界因素干扰、 阳性检 出率低等问题； 核酸具有高稳定性， 随时间和环 境变化小的特点。 当前报道已用作细菌检测 靶标的核酸包括： 胞质外功能基因ecfX、 DNA促旋酶基因gyrB、 运动相关基因fliC、 甘露糖脱 氢酶基因algD  GDP mannose、 外膜脂蛋白基因oprL、 23S  rRNA和16S  rRNA基因等。 其中16S   rRNA具有丰度高(每个细菌都含有5000～75000个核糖体)、 特异性好的特点， 是微生物亲缘 关系鉴定的基础， 是细菌 “种”鉴定的理想检测靶标。 [0005]细菌的16S  rRNA基因全长一般在1450～1540bp之 间， 以16S  rRNA基因全长为检测 靶标， 存在时间长， 检测成本高， 操作复杂， 普及困难的问题。 研 究发现， 细菌的16S  rRNA基 因结构独特， 既有所有细菌共有的保守区域， 又有反映细菌 “种”、“属”差异的可变区， 保守 区和可变区交叉排列。 对于细菌的检测， 并不需要以整个16S  rRNA基因序列为检测靶标， 而 只要以其中一些特异 性片段序列为检测靶标就可完成。 但作为细菌 “种”的16S rRNA特异性 片段序列， 必须满足 “种内普适性 ”、“种间特异性和菌外特异性 ”要求。 所谓种内普适性， 指 “种”内不同株， 均含有此序列； 种间特异 性和菌外特异 性， 是指其它种的细菌及细菌外的生 物， 如真菌和人类基因， 不含此序列。 已有研究者在此方面进行一些研究工作。 如文献报道 了6条16S  rRNA基因片段序列作为铜绿假单胞菌的检测靶标。 遗憾的是， 这些研究者没有给 出相应序列的筛选和验证方法。 事实上， 我们将文献报道的序列片段导入GeneBank16S   rRNA细菌数据库进 行比对， 发现这些序列片段不能满足铜绿假单胞菌检测靶标的特异 性要 求， 见表1所示。 我们认为， 它 们不能作为铜绿假单 胞菌的特异性检测靶标。 [0006]表1文献报道的铜绿假单 胞菌“种”的16S rRNA基因特异片段序列说　明　书 1/10 页 3 CN 114317792 A 3