(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210026401.9 (22)申请日 2022.01.11 (71)申请人 仁宽 （上海） 生物科技有限公司 地址 200120 上海市浦东 新区广丹路2 22弄 6号3层 (72)发明人 蒋涛华　傅坚刚　邵悦　 (74)专利代理 机构 北京睿智保诚专利代理事务 所(普通合伙) 11732 代理人 周新楣 (51)Int.Cl. C12Q 1/6886(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种用于分子诊断的EGFR vIII重排的DNA 标准品、 RNA标准品及其应用 (57)摘要 本发明涉及基因重排标准品技术领域， 本发 明提供了一种用于分子诊断的EGF R vIII重排的 DNA标准品、 RNA标准品及其应用。 本发明是将针 对EGFR‑E1基因的1号内含子的sgRNA构建到载体 pX330上， 得到质粒E1 ‑2， 将针对EGFR ‑E7基因的7 号内含子的sgRNA构建到载体pX330 上， 得到质粒 E7‑3， 将质粒E1 ‑2和质粒E7 ‑3共同转染宿主细 胞， 得重组细胞， 再对重组细胞进行单克隆化， 得 到制备DNA标准品或RNA标准品的细胞， 进而得到 DNA和RNA标准品。 本发明提供的EGFR  vIII重排 标准品序列和细胞， 样品可 以稳定长期提供， 非 常适用于LDT或IVD开发的性能评价和长期的质 控需求。 权利要求书1页 说明书9页 序列表9页 附图4页 CN 114381523 A 2022.04.22 CN 114381523 A 1.一种用于分子诊断的EGFRvIII重排的DNA标准品， 其特征在于， 所述DNA标准品的核 苷酸序列如SEQ  ID NO.34所示。 2.一种用于分子诊断的EGFRvIII重排的RNA标准品， 其特征在于， 所述RNA标准品的核 苷酸序列如SEQ  ID NO.42所示。 3.一种制备权利要求1所述DNA标准品或权利要求2所述RNA标准品的细胞， 其特征在 于， 所述细胞的基因 组重组有权利要求1所述的DNA标准品的核苷酸序列。 4.根据权利要求3所述的细胞， 其特 征在于， 所述细胞以人永生 化细胞系为宿主细胞； 所述宿主细胞选自H EK293、 HCT116、 DLD‑1、 RKO和SW 48中的一种。 5.权利要求3或4所述的制备DNA标准品或RNA标准品的细胞的制备方法， 其特征在于， 包括如下步骤： (1)将针对EGFR ‑E1基因的1号内含子的sgRNA构建到载体pX3 30上， 得到质粒E1 ‑2； (2)将针对EGFR ‑E7基因的7号内含子的sgRNA构建到载体pX3 30上， 得到质粒E7 ‑3； (3)将质粒E1 ‑2和质粒E7 ‑3共同转染宿主细胞， 得重组细胞； (4)对重组细胞进行 单克隆化， 得到制备DNA标准品或RNA标准品的细胞。 6.根据权利 要求5所述的制备DNA标准品或RNA标准品的细胞的制备方法， 其特征在于， 步骤(1)中所述针对EGFR ‑E1基因的1号内含子的sgRNA的序列如SEQ  ID NO.15所示。 7.根据权利 要求6所述的制备DNA标准品或RNA标准品的细胞的制备方法， 其特征在于， 步骤(2)中所述针对EGFR ‑E7基因的7号内含子的sgRNA的序列如SEQ  ID NO.26所示。 8.根据权利 要求7所述的制备DNA标准品或RNA标准品的细胞的制备方法， 其特征在于， 步骤(4)中所述单 克隆化采用有限稀释法进行。 9.权利要求1所述的EGFRvIII重排的DNA标准品或权利要求2所述的EGFRvIII重排的 RNA标准品在制备检测EGFRvI II重排的试剂盒中的应用。 10.权利要求1所述的EGFRvIII重排的DNA标准品或权利要求2所述的EGFRvIII重排的 RNA标准品在LDT或IVD研发体系的性能评价中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114381523 A 2一种用于分子诊断的 EGFR vIII重排的DNA标 准品、 RNA标 准品 及其应用 技术领域 [0001]本发明涉及基因重排标准品技术领域， 尤其涉及一种用于分子诊断的EGFR  vIII 重排的DNA标准品、 RNA标准品及其应用。 背景技术 [0002]表皮生长因子受体( EGFR/ErbB1/HER1)是酪氨酸激酶受体家族的成员， 还包括 ErbB2/HER2/Neu、 ErbB3/HER3和ErbB4/HER4。 所有 这些受体都是跨膜 糖蛋白， 分子量范围从 170kDa到185kDa。 通常， 它的激活涉及配体结合和随后的受体二聚化。 EGF受体的激活可在 Ras/Raf/MAPK、 PI3K/AKT、 JAK/STAT或PLC/PKC通路中诱导信号， 对多种细胞过程产生影响， 包括增殖、 代谢、 凋亡、 细胞存活或分化。 信号级联的终止发生在受体内化后， 主要 是网格蛋 白依赖性内吞作用， 导致其进入早期内体。 此外， 受体可能被转运回细胞膜或在晚期内体和 溶酶体中降解。 [0003]编码EGFR的基因位于7号染色体(p11.2)的短臂上， 由28个外显子组成。 成熟的 EGFR蛋白(1186个氨基酸)由前体蛋 白(1210个氨基酸)在去除N末端部分后 形成。 从N到C末 端， EGFR由参与配体结合和受体二聚化的胞外域(外显子1 ‑16)、 疏水跨膜域(外显子17)和 具有酪氨酸激酶活性的胞内域组成， 其两侧是接头区域和受体的C端部分(外显子18 ‑28)。 细胞内结构域的20个酪氨酸残基中有12个被证明经历 了磷酸化， 这些结合受体激活后募 集 的膜结合或细胞质效应蛋白。 [0004]胶质母细胞瘤(GB M)是成人中最常见的恶性脑肿瘤， 也是所有癌 症中最致命的， 目 前的治疗方法： 手术、 放疗和化疗， 中位 生存期仅为12 ‑15个月。 [0005]在GBM中， EGFR扩增在大多数情况下伴有基因重排。 此类改变涉及特定外显子 或外 显子部分的缺失， 并被指定为EGFR  vI(N末端部分缺失)、 EGFR  vII(外显子14和15缺失)、 EGFR vIII(外显子2‑7缺失)、 EGFR  vIV(外显子25‑27缺失)和EGFR  vV(外显子25–28缺失)。 [0006]在胶质母细胞瘤(GBM)中， 最常检测到的变异之一是EGFR  vIII。 大约50％的GBM患 者中EGFR发生了扩增， 大约50 ‑60％的扩增中同时伴随有EGF R vIII重排。 EGFR  vIII的出现 是由于EGFR外显子2 ‑7的缺失， 产生了一个能够组成型E GFR激活的截短的细胞外结构域。 截 短的细胞外结构域产生了一个新的肽序列， 从而产生了独特的、 GBM细胞特异性、 抗体反应 性EGFR vIII抗原。 其中， EGFR  WT和EGFR vIII的结构示 意图如图1所示。 [0007]在GBM的诊断中， NCCN指南提到了EGFR  amplification和EGFR  mutation， EGFR   vIII的突变可以既称为EGFR  mutation， 又经常会导致EGFR的扩增， 因此是一个重要的诊断 指标。 其中， NC CN‑2021第二版中枢神经系统肿瘤分子标志 物截图如图2所示。 [0008]近些年来， 国内出现很多公司去开发检测EGFR  vIII的试剂盒， 在试剂盒的开发 中， 需要有标准品对整个检测体系做性能评价， 按照第三类医疗器械肿瘤检测试剂盒开发 的指导原则上描述， 用于实验性能评价需要对应的标准品， 标准品不能是质粒， 最好是临床 样本。 但是在实际检测过程中， 临床样本往往是可遇不可求的， 需要正好碰到这样的病人，说　明　书 1/9 页 3 CN 114381523 A 3