(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利 (10)授权公告 号 (45)授权公告日 (21)申请 号 202210024425.0 (22)申请日 2022.01.11 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 114045363 A (43)申请公布日 2022.02.15 (73)专利权人 苏州工业园区强东医药 科技有限 公司 地址 215123 江苏省苏州市工业园区若水 路398号D栋1 1楼1101 专利权人 厦门标健 生物技术有限公司 (72)发明人 李旭新　刘彬　许年爱　黄春华　 顾超逸　 (74)专利代理 机构 苏州新知行知识产权代理事 务所(特殊普通 合伙) 32414 代理人 马素琴(51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/686(2018.01) C12Q 1/6837(2018.01) C12N 15/11(2006.01) 审查员 季璇馨 (54)发明名称 猪繁殖与呼吸综合征病毒鉴别检测试剂盒 (57)摘要 本发明公开了一种猪繁殖与呼吸综合征病 毒鉴别检测试剂盒， 其包含核酸提取组件、 核酸 扩增组件和核酸杂交组件， 所述核酸杂交组件包 含所述基因芯片。 本发明的猪繁殖与呼吸综合征 病毒鉴别检测试剂盒是首款能够同时鉴别检测 猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型、 美洲型、 美洲 型高致病株、 美洲型类NADC30株、 美洲型类 NADC34株的分子生物学检测试剂盒。 权利要求书1页 说明书8页 序列表3页 附图3页 CN 114045363 B 2022.04.22 CN 114045363 B 1.一种猪繁殖与呼吸综合征病毒PRRSV鉴别检测基因芯片， 其包含固相载体， 以及固定 在所述固相载体上的寡核苷酸探针； 其中， 所述寡核苷酸探针包括： Eu‑P探针， 用于检测PR RSV欧洲型， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO: 1所示； Am‑P探针， 用于检测PR RSV美洲型， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO: 2所示； Am‑H‑P探针， 用于检测PR RSV美洲型高致病株， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO: 3所示； Am‑N30‑P1探针， 用于检测PRRSV美洲型类NADC30株， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO: 4所 示； Am‑N30‑P2探针， 用于检测PRRSV美洲型类NADC30株， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO: 5所 示； Am‑N30‑P3探针， 用于检测PRRSV美洲型类NADC30株， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO: 6所 示； Am‑N34‑P1探针， 用于检测PRRSV美洲型类NADC34株， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO: 7所 示； 以及 Am‑N34‑P2探针， 用于检测PRRSV美洲型类NADC34株， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO: 8所 示。 2.一种猪繁殖与呼吸综合征病毒PRRSV鉴别检测的核酸杂交组件， 其包含权利要求1所 述的基因芯片和用于核酸杂交的试剂。 3.一种猪繁殖与呼吸综合征病毒PRRSV鉴别检测试剂盒， 其包含权利要求1所述的基因 芯片。 4.根据权利要求3所述的试剂盒， 其还 包含下述用于扩增目标基因片段的引物组： 用于扩增PRRSV欧洲型的目标基因片段的引物组1： 上游引物的核苷酸序列如SEQ  ID  NO: 9所示， 下游引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO:10所示； 用于扩增PRRSV美洲型的目标基因片段的引物组2： 上游引物的核苷酸序列如SEQ  ID  NO: 11所示， 下游引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO:12所示； 用于扩增 PRRSV美洲型高致病株的目标基因片段的引物组3： 上游引物的核苷酸序列如 SEQ ID NO: 13所示， 下游引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO:14所示； 用于扩增PRRSV类NADC30株 的目标基因片段的引物组4： 上游引 物的核苷酸序列如SEQ   ID NO: 15所示， 下游引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO:16所示； 以及 用于扩增PRRSV类NADC34株 的目标基因片段的引物组5： 上游引 物的核苷酸序列如SEQ   ID NO: 17所示， 下游引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO:18所示。 5.根据权利要求 4所述的试剂盒， 其中， 所述引物组1 ‑5被预混装于一个容器中。 6.根据权利要求4所述的试剂盒， 其中， 所述引物组1 ‑5中的各个下游引物的5'端经生 物素标记。 7.根据权利要求4所述的试剂盒， 其包含核酸提取组件、 核酸扩增组件和核酸杂交组 件； 其中， 所述核酸 提取组件 包含用于核酸 提取的试剂； 所述核酸扩增组件包含用于核酸扩增的试剂， 所述用于核酸扩增的试剂包含所述引物 组1‑5的预混液； 所述核酸杂交 组件包含所述基因芯片和用于核酸杂交的试剂。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114045363 B 2猪繁殖与呼吸综合征病毒鉴别检测试剂盒 技术领域 [0001]本发明属于动物传染病病原体分子检测技术领域， 具体涉及一种能够检测并鉴别 不同猪繁殖与呼吸综合征病毒毒株包括欧洲型、 美洲型、 美洲型高致病株、 美洲型类NAD C30 株、 美洲型类NADC 34株的鉴别检测试剂盒及其应用。 背景技术 [0002]猪繁殖与呼吸综合征俗称猪蓝耳病， 是我国 《一、 二、 三类动 物疫病病种名录》 中规 定的二类动物疫病， 其是由猪繁殖与呼吸综合征病毒 （Porcinereproductive  and  respiratory  syndrome  virus, PRRSV） 引起的一种高度接触性传染病， 主要怀孕母猪早 产、 流产、 死胎以及仔 猪的呼吸道系统症状。 [0003]近年来， PRRSV在流行过程中不断演化重组， 出现了多种新 的流行毒株， 例如欧洲 型、 美洲型经典株、 美洲型高致病株、 美洲型类NADC30株、 美洲型类NADC34株等， 不同类型的 PRRSV的鉴别检测对于动物疫病流行病学调查及防控手段的选择有重要意 义。 [0004]PRRSV是一种RNA病毒， 通常， 技术人员会采用荧光RT ‑PCR法或PCR ‑电泳法来检测 PRRSV病毒的核酸， 并通过设计针对不同毒株的特异 性引物、 探针来对各种类型的毒株进 行 鉴别。 [0005]但是， 荧光RT ‑PCR法通常需要使用特异性Taqman水解探针， 需要鉴别的毒株类型 越多， 所使用的特异 性Taqman水解探针就越多， 势必增加探针之间的相互干扰， 影响检测的 灵敏度。 而且， 不同探针需要用不同颜色的荧光信号加以识别， 探针种类的增加要求荧光 PCR仪具有 更多的荧光检测通道， 而实际上在广大基层检测实验室普遍配置的荧光P CR仪中 双通道荧光PCR仪占绝大多 数， 四通道以上的荧光PCR仪价格昂贵， 并不适合在基层推广。 电 泳法虽然不需要使用荧光探针， 但是其只能通过分析片段大小区分来自不同毒株的扩增产 物， 当这些扩增产物大小接近时则无法加以区分， 因而分辨率低。 而且， 电泳法还存在下述 问题： 容易受非特异性扩增产物的干扰、 特异性差； 荧光染料的背景强导致信噪比低、 检测 灵敏度低。 [0006]此外， 基因芯片已经应用于分子生物学检测领域。 所述基因芯片是将目标序列特 异性的核酸探针固定在固相基质反应孔中的特定位置以形成微阵列， 在对生物样品进 行核 酸提取和核酸扩增后， 将核酸扩增产物与基因芯片共同温育， 使得目标序列的扩增产物与 基因芯片的特定位置上的特异性核酸探针杂交形成核酸杂交产物， 然后清洗去除未杂交的 扩增产物， 并使所述基因芯片的特定位置上的核酸杂交产物产生可识读的信号(化学显 色、 化学发光等)， 从而能够判定是否存在与所述特异 性核酸探针杂交的核酸扩增产 物。 与荧光 RT‑PCR法相比， 基因芯片法通过特定位置来区分不同核酸探针， 无需对不同核酸探针进行 不同颜色的荧光标记， 甚至无需使用荧光P CR仪器， 因此不存在荧光探针之间相互干扰的问 题， 也不存在需要匹配昂贵的检测仪器的问题。 与电泳 法相比， 基因芯片法的分辨率和检测 灵敏度都明显更高。 [0007]但是， 即使采用 基因芯片法， 对于上述这么多种类型的PRRSV毒株的鉴别检测而说　明　书 1/8 页 3 CN 114045363 B 3