(19)国家知识产权局 (12)发明 专利 (10)授权公告 号 (45)授权公告日 (21)申请 号 202210029938.0 (22)申请日 2022.01.12 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 114032341 A (43)申请公布日 2022.02.11 (73)专利权人 广州生凌医疗科技有限公司 地址 510000 广东省广州市增城区新塘镇 民营大道西7号自编6号 (72)发明人 陈伟珊　孙江山　吴纯阳　 (74)专利代理 机构 南昌逸辰知识产权代理事务 所(普通合伙) 36145 专利代理师 刘林艳 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6851(2018.01)C12N 15/11(2006.01) C12R 1/93(2006.01) 审查员 于淼 (54)发明名称 一种四种病毒的核酸检测试剂盒、 引物探针 组及检测方法 (57)摘要 本发明提出了一种四种病毒的核酸检测试 剂盒、 引物探针组及检测方法， 其中， 轮状病毒的 引物为序列RV ‑1、 RV‑2， 探针为序列RV ‑3； 诺如病 毒GI型的引物为序列NVGI ‑1、 NVGI‑2， 探针为序 列NVGI‑3； 诺如病毒GII型的引物为序列NVGII ‑ 1、 NVGII‑2， 探针为序列NVGII ‑3； 札如病毒的引 物为序列SaV ‑1、 SaV‑2、 SaV‑3和SaV‑4， 探针为序 列SaV‑5。 本发明检测试剂盒能够同时检测轮状 病毒、 诺如病毒GI型、 GII型、 札如病毒四种致病 病毒， 减少了因为误判选错检测试剂消耗的时 间， 对疾病的快速确诊 有一定的作用。 权利要求书1页 说明书7页 序列表3页 附图3页 CN 114032341 B 2022.05.06 CN 114032341 B 1.一种轮状病毒、 诺如病毒GI型、 GII型、 札如病毒的四重核酸检测试剂盒， 其特征在 于， 该试剂盒包括轮 状病毒、 诺如病毒GI型、 GI I型、 札如病毒的引物探针组： 其中， 轮状病毒的引 物为序列RV ‑1、 RV‑2， 探针为序列RV ‑3； 其中上游引 物的核苷酸序 列如SEQ ID NO:1所示； 下游引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO:2所示； 探针的核苷酸序列如 SEQ ID NO:3所示； 诺如病毒GI型的引物为序列NV GI‑1、 NVGI‑2， 探针为序列NVGI ‑3； 其中上游引物的核苷 酸序列如SEQ  ID NO:4所示； 下游引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO:5所示； 探针的核苷酸序 列如SEQ ID NO:6所示； 诺如病毒GII型的引物为序列NV GII‑1、 NVGII‑2， 探针为序列NV GII‑3； 其中上游引物的 核苷酸序列如SEQ  ID NO:7所示； 下游引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO:8所示； 探针的核苷 酸序列如SEQ  ID NO:9所示； 札如病毒的引物为序列SaV ‑1、 SaV‑2、 SaV‑3和SaV‑4， 探针为序列SaV ‑5； 其中上游引物 的核苷酸序列如SEQ  ID NO:10‑12所示； 下游引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO:13所示； 探针 的核苷酸序列如SEQ  ID NO:14所示； 所述轮状病毒探针序列RV ‑3的5’端用ROX修饰， 3 ’端用BHQ2修饰； 所述诺如病毒G Ⅰ型探 针序列NVGI ‑3的5’端用JOE修饰， 3 ’端用BHQ1修饰； 所述诺如病毒G Ⅱ型探针序列NVGII ‑3的 5’端用CY5修饰， 3 ’端用BHQ2修饰； 所述札如病毒探针序列SaV ‑5的5’端用FAM修饰， 3 ’端用 MGB修饰； 其中正向引物、 反向引物、 特异性 荧光探针的摩尔比为： 轮状病毒： （1 ‑2） ： （1‑2） ： 2； 诺如病毒GI型： （5 ‑10） ： （5‑10） ： 6； 诺如病毒GI I型： （1‑3） ： （1‑3） ： 6； 札如病毒： （3 ‑4） ： （1‑2） ： （1‑2） ： （3‑5） ： 3。 2.根据权利 要求1所述轮状病毒、 诺如病毒GI型、 GII型、 札如病毒的四重核酸检测试剂 盒， 其特征在于， 其中正向引物、 反向引物、 特异性 荧光探针的摩尔比为： 轮状病毒： 1.8： 1.8： 2； 诺如病毒GI型： 8： 8： 6； 诺如病毒GI I型： 2： 2： 6； 札如病毒： 3.6： 1.8： 1.8： 4： 3 。 3.根据权利 要求1所述轮状病毒、 诺如病毒GI型、 GII型、 札如病毒的四重核酸检测试剂 盒， 其特征在于， 其成分包括： (1)RT‑PCR反应液： 包括 荧光PCR缓冲液、 dNTP、 DEPC水； (2)引物探针混合液： 包括引物RV ‑1、 RV‑2； NVGI‑1、 NVGI‑2； NVGII‑1、 NVGII‑2； SaV‑1、 SaV‑2、 SaV‑3和SaV‑4； 和探针RV ‑3、 NVGI‑3、 NVGII‑3、 SaV‑5； (3)混合酶液： 包括RNA酶抑制剂， 逆转录酶， DNA聚合酶； (4)阳性对照： ： 包括含有引物RV ‑1、 RV‑2； NVGI‑1、 NVGI‑2； NVGII‑1、 NVGII‑2； SaV‑1、 SaV‑2、 SaV‑3和SaV‑4扩增目的片段的轮 状病毒、 诺如病毒GI型、 GI I型、 札如病毒源性RNA； (5)阴性对照： 为TE溶 液。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114032341 B 2一种四种病毒 的核酸检测试剂盒、 引物探针组及检测方 法 技术领域 [0001]本发明涉及 基因工程技术领域， 具体涉及 轮状病毒、 诺如病毒 GI型、 GII型、 札如病 毒四重核酸检测试剂盒、 引物探针组及检测方法。 背景技术 [0002]轮状病毒、 诺如病毒、 札如病毒是病毒性肠胃炎中最常见的病原体。 [0003]轮状病毒 （rotavirus,RV） 属呼肠孤病毒科， 为球型， 有宽壳盖、 短幅和薄边的双链 RNA病毒， 可引起人类和多种动物腹泻， 在所有腹泻病毒中感染比列最大。 其中A、 B、 C三组可 对人有致病性， A组引起婴幼儿急性胃肠炎 常导致婴幼儿重症腹泻， 占整个腹泻病的1/4， 在 发展中国家每年约有6 0万婴幼儿由于轮 状病毒感染引起脱水 死亡。 [0004]诺如病毒 （Norovirus,NV） 是一组杯状病毒科的病毒， 诺如病毒感染影响胃和肠 道， 引起胃肠炎或 “胃肠流感 ”。 诺如病毒分5个基因组(G Ⅰ～GⅤ)， 其中只有G Ⅰ、 GⅡ和GⅣ可 以感染人， 而G Ⅲ、 GⅤ分别感染牛和鼠。 我国目前最常见的诺如病毒为G Ⅰ、 GⅡ型。 感染者发 病突然， 主要症状为恶心、 呕吐、 发热、 腹痛和腹泻。 儿童患者呕吐普遍， 成人患者腹泻为多， 24h内腹泻4～8次， 粪便为稀水便或水样便， 无粘液脓血。 [0005]札如病毒(Sapovirus,SaV)属 于人类杯状病毒 （HuCV） ， 能在世界范围内引起人类 急性胃肠炎 （AGE） 的爆发和 散发。 近年来， SaV在世界范围内引起的非细菌性 胃肠炎爆发有 增加趋势。 [0006]因此， 针对疫情的快速暴发、 传播范围广的特点， 建立灵敏度高、 特异性强、 检测时 间短、 检测成本低、 操作简单方便、 器材要求不高的轮状病毒、 诺如病毒GI型、 GII型、 札如病 毒检测技术， 对病例的快速识别和疫情的传播控制具有非常重要的意义， 对公共卫生和食 品安全防控具有重要的价 值。 发明内容 [0007]本发明的目的在于提出轮状病毒、 诺如病毒GI型、 GII型、 札如病毒四重核酸检测 试剂盒、 引物探针组及检测方法， 能够同时检测轮状病毒、 诺如病毒GI型、 GII型、 札如病毒 四种致病病毒， 减少 了因为误判选错检测试剂消 耗的时间， 对疾病的快速确诊有一定的作 用。 [0008]本发明的技 术方案是这样实现的： [0009]本发明提供一种轮 状病毒、 诺如病毒GI型、 GI I型、 札如病毒的引物探针组， [0010]其中， 轮状病毒的引物为序列RV ‑1、 RV‑2， 探针为序列RV ‑3； 其中上游引物的核苷 酸序列如SEQ  ID NO:1所示； 下游引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO:2所示； 探针的核苷酸序 列如SEQ ID NO:3所示； [0011]诺如病毒GI型的引物为序列NVGI ‑1、 NVGI‑2， 探针为序列NVGI ‑3； 其中上游引物的 核苷酸序列如SEQ  ID NO:4所示； 下游引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO:5所示； 探针的核苷 酸序列如SEQ  ID NO:6所示；说　明　书 1/7 页 3 CN 114032341 B 3