(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利 (10)授权公告 号 (45)授权公告日 (21)申请 号 202210029979.X (22)申请日 2022.01.12 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 114045356 A (43)申请公布日 2022.02.15 (73)专利权人 仲恺农业工程学院 地址 510000 广东省广州市海珠区纺织路 东沙街24 号 (72)发明人 林进添　梁芳　吴仲真　舒本水　 宾淑英　杨清　 (74)专利代理 机构 广州粤高专利商标代理有限 公司 44102 代理人 赵崇杨 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (56)对比文件 CN 112280879 A,2021.01.2 9 CN 107354224 A,2017.1 1.17 CN 10970 6227 A,2019.0 5.03CN 111187804 A,2020.0 5.22 CN 109576264 A,2019.04.0 5 CN 105052659 A,2015.1 1.18 Matthew S. Wheatley 等.Highly Sensitive and Rapid Detecti on of Citrus Huanglongbing Pathogen ( ‘Candidatus Liberibacter asiaticus ’) Using Cas12a- Based Methods. 《Phytopatho logy》 .2021,第1 11 卷(第12期), Dilip Kumar Ghosh 等.Devel opment of a recombinase polymerase based isothermal amplification combined with lateral fl ow assay (HLB-RPA-LFA) for rapid detecti on of "Candidatus L iberibacter asiaticus". 《PLoS One》 .2018,第13卷(第12期),第e02085 30 页. Kihye Shi n 等.Sensitive and Rapid Detection of Citrus Scab Usi ng an RPA- CRISPR/Cas12a System Combi ned with a Lateral Fl ow Assay. 《Plants》 .2021,第10卷 (第10期),第1-10页. (续) 审查员 于淼 (54)发明名称 一种基于RPA -CRISPR-Cas12a体系可视化检 测柑橘黄龙病的试剂盒及方法 (57)摘要 本发明公开了一种基于RPA ‑CRISPR‑Cas12a 体系可视化检测柑橘黄龙病的试剂盒及方法。 所 述试剂盒包含RPA引物和crRNA引导序列； 通过先 对待测样品进行RPA扩增， 再在crRNA序列介导 下， 引导CRISPR ‑Cas12a体系对RPA扩增产物进行 识别结合并切割目标双链DNA 激活非特异性核 酸 酶功能， 然后任意切割体系中的ssDNA荧光探针 得到裂解产物， 最后通过裂解产物的显色检测进 行判断。 本发明通过RPA扩增及crRNA识别可双重 特异地对检测柑橘黄龙病进行检测， 特异性强，且在灵敏度上可低至2拷贝/μL， 可以更早发现 感染柑橘黄龙病的植株， 对柑橘黄龙病进行防 治。 [转续页] 权利要求书1页 说明书7页 序列表1页 附图4页 CN 114045356 B 2022.04.26 CN 114045356 B (56)对比文件 段玉 等.柑桔黄龙病菌的重组酶聚合酶扩 增(RPA)检测. 《中国南方果 树》 .2021,第5 0卷(第 5期),第1 1-20页.孙大光 等.柑橘黄龙病 病原菌的鉴定及 16SrDNA 序列分析. 《福建农业学报》 .201 1,第26 卷(第6期),第1027-10 33页.2/2 页 2[接上页] CN 114045356 B1.一种检测柑橘黄龙病亚洲种的试剂盒， 其特征在于， 包括RPA引物、 crRNA引导序列、 Cas12a酶和ssDNA荧光探针； 所述RPA引物的核苷酸序列为： RPA ‑CLA‑F： 5’ ‑GTGAGTAACGCGT AGGAATCTACCTTTTTCTA ‑3’， RPA‑CLA‑R： 5’ ‑ATCCCTCTCCAATAAAATCTTTCCCCCAATA ‑3’， 所述 crRNA引导序列为5 ’ ‑mC*U*UAAUUUCUA CUAAGUGUAGAUUACGGGAUAACGCAUGGAAA C*G*mU‑3’， *为 硫代修饰， m为甲氧基修饰。 2.根据权利要求1所述试剂盒， 其特征在于， 所述ssDNA荧光探针为5 ’端FAM标记、 3 ’端 BHQ1标记的单链核苷酸序列， 或5 ’端FITC标记、 3 ’端Biotin标记的单链核苷酸序列。 3.根据权利要求2所述试剂盒， 其特征在于， 所述ssDNA荧光探针的核苷酸序列为5 ’ ‑ FAM‑TTTTTT‑BHQ1‑3’、 5’ ‑FAM‑ggTTggTgTgg‑BHQ1‑3’或5’ ‑FITC‑TTTTTT‑Biotin‑3’。 4.根据权利要求1所述试剂盒， 其特征在于， 还包含柑橘黄龙病亚洲种16srRNA基因片 段的质粒 标准品。 5.根据权利要求1所述试剂 盒， 其特征在于， 所述试剂 盒包含柑橘黄龙病亚洲种胶体金 检测试纸条， 所述检测试纸条包括： 底板、 样品垫、 胶体金结合垫、 层析膜和吸水垫， 所述样 品垫、 胶体金结合垫、 层析膜和吸水垫在底板上按照顺序依次固定； 所述胶体金结合垫内含 有胶体金标记的抗FITC的兔源抗体， 所述层析膜上设有相互分离的检测线T和质控线C， 检 测线T包被抗兔抗的羊源抗体， 质控线C包被Bi otin的配体Avidin。 6.权利要求1～5任一所述试剂盒在可视化检测柑橘黄龙病中的应用。 7.一种可视化检测柑橘黄龙病亚洲种的方法， 其特 征在于， 包括如下步骤： S1.提取待测样品基因 组DNA； S2.以步骤S1的DNA为模板， 利用权利要求1中所述RPA引物进行等温扩增反应， 得到RPA 扩增产物； S3.利用权利要求1中所述crRNA引导序列制备Cas12a/crRNA复合物， 再加入ssDNA荧光 探针及步骤S2的RPA扩增产物， 在CRIS PR/cas12a体系中进行裂解反应， 得到裂解产物； S4.将步骤S3的裂解产物在蓝绿光下进行显色或裸眼观察， 若裂解产物在蓝绿光照射 下无荧光亮度或裸眼观察无亮度， 则表示待测样品未感染柑橘黄龙病亚洲种， 若裂解产物 在蓝绿光照射下有荧光亮度或裸眼观察有亮度， 则表示待测样品有感染柑橘黄龙病亚洲； 或将步骤S3得到的裂解产 物使用胶体金试纸条进 行显色检测， 若待测样品检测线 出现红色 条带或待测样品检测线和阴性样品质控线位置均出现红色条带， 则表示待测样品感染柑橘 黄龙病亚洲种， 若检测线不出现红色条带， 在质控线 上出现红色条带， 则表示待测样品未感 染柑橘黄龙病亚洲种。 8.根据权利要求7所述方法， 其特征在于， 步骤S2所述等温扩增反应的体系为： 10  μM  RPA‑CLA‑F 2.4 μL， 10 μM RPA‑CLA‑R 2.4 μL， Rehydration  Buffer 29.5 μL， 280mM   MgOAc 2.5 μL， RNase ‑free H2O加至49 μL， 样品DNA  1 μL， 混合均匀后加 入单管酶干粉末 中重悬， 于 39℃反应40分钟。 9.根据权利要求7所述方法， 其特征在于， 步骤S3所述裂解反应的体系为： RNase  free  H2O 66.67 μL， 10× NEB buffer 2 10 μL， 1 μM Cas12a 3.33 μL， 300  mM crRNA 10 μL， 置 于37℃中15min， 取出放室温备用； 再加入10  μM ssDNA荧光探针2.5  μL以及RPA扩增产物 7.5 μL， 37℃反应2个小时。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114045356 B 3