(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210032516.9 (22)申请日 2022.01.12 (71)申请人 北京艾克伦医疗科技有限公司 地址 102200 北京市昌平区昌平科技园区 白浮泉路10号2号楼北控 科技大厦3层 302 (72)发明人 胡鹏程　李明明　蒲珏　 (74)专利代理 机构 北京慧诚智道知识产权代理 事务所 (特殊普通合伙) 11539 专利代理师 殷炳蕾 (51)Int.Cl. C12Q 1/6886(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 通过外泌体miRNA标志物 鉴定结直肠癌状态 的检测试剂盒和方法 (57)摘要 本文提供了用 于在受试者中进行结直肠癌 状态诊断的检测试剂盒， 其包括用于检测来自所 述受试者的生物样品中miRNA生物标志物水平的 检测试剂， 所述miRNA生物标志物选自hsa ‑miR‑ 320a‑3p、 hsa‑miR‑19a‑3p、 hsa‑miR‑19b‑3p、 hsa‑miR‑31‑5p、 hsa‑miR‑92a‑3p、 hsa‑miR‑ 196a‑5p、 hsa‑miR‑409‑5p、 hsa‑miR‑520d‑5p和 hsa‑miR‑33b‑3p及其任 意组合。 本文还 提供了在 受试者中进行结直肠癌状态诊断的方法。 本文提 供的检测试剂盒和方法为早期结直肠癌的筛查、 诊断和预后分析提供一条高效、 无创、 准确的新 途径。 权利要求书4页 说明书15页 序列表9页 附图5页 CN 114672560 A 2022.06.28 CN 114672560 A 1.用于在受试者中进行结直肠癌状态诊断的检测试剂 盒， 包括用于检测来自所述受试 者的生物样品中miRNA生物标志物水平 的检测试剂， 所述miRNA生物标志物选自hsa ‑miR‑ 320a‑3p、 hsa‑miR‑19a‑3p、 hsa‑miR‑19b‑3p、 hsa‑miR‑31‑5p、 hsa‑miR‑92a‑3p、 hsa‑miR‑ 196a‑5p、 hsa‑miR‑409‑5p、 hsa‑miR‑520d‑5p和hsa‑miR‑33b‑3p及其任意组合。 2.如权利要求1所述的检测试剂盒， 其中所述miRNA生物标志物包括hsa ‑miR‑320a‑3p、 hsa‑miR‑19b‑3p或hsa‑miR‑196a‑5p； 包括hsa ‑miR‑320a‑3p、 hsa‑miR‑31‑5p和hsa‑miR‑ 409‑5p； 或者包括hsa ‑miR‑19b‑3p、 hsa‑miR‑196a‑5p和hsa‑miR‑33b‑3p。 3.如权利要求1或2所述的检测试剂盒， 其中所述miRNA生物标志物为hsa ‑miR‑320a‑ 3p、 hsa‑miR‑19a‑3p、 hsa‑miR‑19b‑3p、 hsa‑miR‑31‑5p、 hsa‑miR‑92a‑3p、 hsa‑miR‑196a‑ 5p、 hsa‑miR‑409‑5p、 hsa‑miR‑520d‑5p和hsa‑miR‑33b‑3p。 4.如权利要求1 ‑3任一项所述的检测试剂盒， 其中所述结直肠癌状态包括结直肠癌易 感性或者结直肠癌的存在、 进 展、 亚型、 分期和/或分化状态。 5.如权利要求1 ‑4任一项所述的检测试剂 盒， 其中所述结直肠癌状态为结直肠癌 I期或 II期， 所述 miRNA生物标志物为hsa ‑miR‑320a‑3p、 hsa‑miR‑19b‑3p和/或hsa ‑miR‑196a‑5p； 所述结直肠癌状态为腺癌， 所述miRNA生物标志物为hsa ‑miR‑320a‑3p、 hsa‑miR‑19a‑3p、 hsa‑miR‑31‑5p、 hsa‑miR‑92a‑3p、 hsa‑miR‑196a‑5p、 hsa‑miR‑409‑5p和/或hsa ‑miR‑33b‑ 3p； 所述结直肠癌状态为粘液腺癌， 所述miRNA生物标志物为hsa ‑miR‑320a‑3p、 hsa‑miR‑ 31‑5p、 hsa‑miR‑196a‑5p和/或hsa ‑miR‑19b‑3p； 所述结直肠癌状态为印戒细胞癌， 所述 miRNA生物标志物为hsa ‑miR‑320a‑3p、 hsa‑miR‑92a‑3p、 hsa‑miR‑196a‑5p和/或hsa ‑miR‑ 33b‑3p； 或者所述结直肠癌状态为其他类型结直肠癌， 所述miRNA生物标志物为hsa ‑miR‑ 320a‑3p、 hsa‑miR‑19a‑3p、 hsa‑miR‑19b‑3p、 hsa‑miR‑31‑5p、 hsa‑miR‑196a‑5p、 hsa‑miR‑ 409‑5p、 hsa‑miR‑520d‑5p和/或hsa ‑miR‑33b‑3p。 6.如权利 要求1‑5任一项所述的检测试剂盒， 其中所述检测miRNA生物标志物水平的检 测试剂包括逆转录引物、 PCR扩增引物对和/或Taqman探针。 7.如权利要求1 ‑6任一项所述的检测试剂盒， 其中： 用于检测hsa ‑miR‑320a‑3p的水平的检测试剂包括： 包括SEQ  ID NO： 10所示序列的逆 转录引物； 包括SEQ  ID NO： 19和28所示序列的PCR扩增引物对； 和/或包括SEQ  ID NO： 29所 示序列的Taqman探针； 用于检测hsa ‑miR‑19a‑3p的水平的检测试剂包括： 包括SEQ  ID NO： 11所示序列的逆转 录引物； 包括SEQ  ID NO： 20和28所示序列的PCR扩增引物对； 和/或包括SEQ  ID NO： 30所示 序列的Taqman探针； 用于检测hsa ‑miR‑19b‑3p的水平的检测试剂包括： 包括SEQ  ID NO： 12所示序列的逆转 录引物； 包括SEQ  ID NO： 21和28所示序列的PCR扩增引物对； 和/或包括SEQ  ID NO： 31所示 序列的Taqman探针； 用于检测hsa ‑miR‑31‑5p的水平的检测试剂包括： 包括SEQ  ID NO： 13所示序列的逆转 录引物； 包括SEQ  ID NO： 22和28所示序列的PCR扩增引物对； 和/或包括SEQ  ID NO： 32所示 序列的Taqman探针； 用于检测hsa ‑miR‑92a‑3p的水平的检测试剂包括： 包括SEQ  ID NO： 14所示序列的逆转 录引物； 包括SEQ  ID NO： 23和28所示序列的PCR扩增引物对； 和/或包括SEQ  ID NO： 33所示权　利　要　求　书 1/4 页 2 CN 114672560 A 2序列的Taqman探针； 用于检测hsa ‑miR‑196a‑5p的水平的检测试剂包括： 包括SEQ  ID NO： 15所示序列的逆 转录引物； 包括SEQ  ID NO： 24和28所示序列的PCR扩增引物对； 和/或包括SEQ  ID NO： 34所 示序列的Taqman探针； 用于检测hsa ‑miR‑409‑5p的水平的检测试剂包括： 包括SEQ  ID NO： 16所示序列的逆转 录引物； 包括SEQ  ID NO： 25和28所示序列的PCR扩增引物对； 和/或包括SEQ  ID NO： 35所示 序列的Taqman探针； 用于检测hsa ‑miR‑520d‑5p的水平的检测试剂包括： 包括SEQ  ID NO： 17所示序列的逆 转录引物； 包括SEQ  ID NO： 26和28所示序列的PCR扩增引物对； 和/或包括SEQ  ID NO： 36所 示序列的Taqman探针； 以及 用于检测hsa ‑miR‑33b‑3p的水平的检测试剂包括： 包括SEQ  ID NO： 18所示序列的逆转 录引物； 包括SEQ  ID NO： 27和28所示序列的PCR扩增引物对； 和/或包括SEQ  ID NO： 37所示 序列的Taqman探针。 8.如权利要求1 ‑7任一项所述的检测试剂盒， 还包括用于检测作为内参基因的hsa ‑ miR‑let‑7d的水平的检测试剂； 所述检测试剂包括： 包括SEQ  ID NO： 38所示序列的逆转录 引物； 包括SEQ  ID NO： 39和28所示序列的PCR扩增引物对； 和/或包括SEQ  ID NO： 40所示序 列的Taqman探针。 9.如权利要求1 ‑8任一项所述的检测试剂盒， 还包括用于从所述生物样品中分离外泌 体的试剂； 任选地， 还 包括用于从所述外泌体提取miRNA的试剂。 10.如权利要求1 ‑9任一项所述的检测试剂盒， 还包括记载有根据所述miRNA生物标志 物水平基于 逻辑回归来判断所述受试者中结直肠癌状态的说明书。 11.如权利要求1 ‑10任一项所述的检测试剂盒， 其中所述生物样品选自血液、 血清、 血 浆、 粪便、 乳液、 腹水、 尿和组织活检； 优选血浆、 血清或粪便 。 12.在受试者中鉴定结直肠癌状态的方法， 包括： 1)从来自所述受试者的生物样品中分离 外泌体； 2)检测所述外泌体中miRNA生物标志物水平， 所述miRNA生物标志物选自hsa ‑miR‑ 320a‑3p、 hsa‑miR‑19a‑3p、 hsa‑miR‑19b‑3p、 hsa‑miR‑31‑5p、 hsa‑miR‑92a‑3p、 hsa‑miR‑ 196a‑5p、 hsa‑miR‑409‑5p、 hsa‑miR‑520d‑5p和hsa‑miR‑33b‑3p及其任意组合；