(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210032285.1 (22)申请日 2022.01.12 (71)申请人 上海交通大 学医学院附属第九人民 医院 地址 200011 上海市黄浦区制造局路6 39号 (72)发明人 孙树洋　张志愿　姚艳丽　杨桂柱　 王玉珏　 (74)专利代理 机构 北京金信知识产权代理有限 公司 11225 代理人 李雪芹 (51)Int.Cl. G01N 33/574(2006.01) G01N 33/577(2006.01) C12Q 1/02(2006.01) C12Q 1/6851(2018.01)C12Q 1/6886(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种用于筛选西妥昔单抗原发耐药生物标 志物的方法、 用该方法筛选的生物标志物及其用 途 (57)摘要 本申请涉及一种用于筛选头颈鳞癌西妥昔 单抗原发耐药生物标志物的方法、 用该方法筛选 的生物标志物及其用途。 本申请通过建立头颈鳞 癌患者肿瘤组织来源的小鼠异种移植瘤模型 (patient ‑derived xenograft， PDX)， 获取患者 准确的临床信息， 构建头颈鳞癌PDX模型平台。 在 构建的PDX模型平台中， 参考临床二期研究模式， 选择患者对应的PDX模型入组开展PDX模型临床 替代性试验， 进行西妥昔单抗药物治疗， 借助全 外显子测序及转录组测序， 筛选西妥昔单抗的原 发耐药生物标志物。 经试验验证， 本申请提供的 头颈鳞癌西妥昔单抗原发耐药的生物标志物是 预测头颈鳞癌患者对西妥昔单抗药效非常可靠 的标志物。 权利要求书2页 说明书10页 序列表4页 附图4页 CN 114354936 A 2022.04.15 CN 114354936 A 1.一种利用患 者肿瘤组织来源的异种移植瘤模型(PDX模型)临床替代性试验筛选头颈 鳞癌西妥昔单抗原发耐药生物标志 物的方法， 所述方法包括以下步骤： (1)利用头 颈鳞癌患者肿瘤组织在免疫缺陷鼠中构建头 颈鳞癌PDX模型； (2)获取头颈鳞癌PDX模型对应患者的临床信息， 包括既往病史、 临床治疗情况、 用药情 况等； (3)头颈鳞癌PDX模型第一队列的构 建： 依托建立的头颈鳞癌PDX模型生物样本库， 根据 对应患者的临床信息， 随机筛选若干例头颈鳞癌PDX模型入组， 将每例活体保存的PDX移植 瘤样本接种至裸鼠皮下， 用于后续西妥昔单抗临床替代性试验； (4)开展西妥昔单抗PDX模型临床替代性试验： 待头颈鳞癌PDX模型肿瘤体积达到一定 值后， 将每个PDX病例随机 分为对照组和西妥昔单抗单药治疗组， 开始药物治疗， PDX模 型分 别接受PBS或西妥昔单抗腹腔注射， 每周对小鼠进行肿瘤体积和体重测量； (5)PDX模型临床替代性试验中西妥昔单抗药效评估： 为了评估对西妥昔单抗的药物响 应情况， 通过PDX模型中移植瘤用药前后的体积变化来评估药物反应， 具体标准如下： 1)肿 瘤完全消退(mCR)， 肿瘤体积至少减少40％； 2)肿瘤部分消退(mPR)， 肿瘤体积减少20％～ 40％； 3)疾病进展(mPD)， 肿瘤体积至少增加30％； 4)疾病稳定(mSD)， 肿瘤体积变化在30％ 增长和20％减少之间； mP D模型被确定为原发耐药模型， mCR模型定义 为敏感模型； (6)借助模型临床替代性试验筛选原发耐药候选药效标志物： 对所述原发耐药模型及 敏感模型分别进 行全外显子组测序及转录组测序， 根据原发耐药模型与敏感模型的差异基 因变异谱和/或差异基因表达谱， 结合基因功能与信号通路分析结果， 初步筛选出原发耐药 候选药效标志 物； (7)开展独立PDX模型临床替代性试验： 依托头颈鳞癌PDX模型生物样本库， 根据对应患 者的临床信息， 再次 随机筛选若干例头颈鳞癌PDX模型作为第二队列入组， 所选第二队列与 所述第一队列不重叠， 以与步骤(4)中相同的方式， 对入组PDX模型进行西妥昔单抗单药处 理， 用药若干周， 例如3周后， 进行移植瘤的样本采集与活体保存， 通过评估西妥昔单抗药 效， 区分出原发耐药模型及敏感模型； (8)利用独立PDX模型临床替代性试验验证药效标志物： 利用独立PDX模型临床替代性 试验中的样本， 采用实时荧光定量PCR(qRT ‑PCR)方法， 对候选变异基因和表达基因进行验 证， 筛选出基因变异或表达趋势在所述第一和第二队列中一致的基因， 将所选的药效预测 性生物标志物绘制受试者工作特征曲线(Receiver  Operating  Characteristic  Curve， ROC)， 采用SPSS  21.0统计学软件进行分析， 并计算曲线下面积AUC， 选择AUC>0.80的指标， 最终确定所述第一和第二队列中发现的所述头 颈鳞癌西妥昔单抗原发耐药生物标志 物。 2.根据权利要求1所述的方法， 其中， 通过所述方法筛选的头颈鳞癌西妥昔单抗原发耐 药生物标志物选自以下各项： 转录因子SIX2(Sine  Oculis Homeobox  Homolog 2)、 基本转 录元件结合蛋白KLF9(Kruppel  Like Factor 9)、 聚腺苷二磷酸核糖聚合酶PARP3(Poly (ADP‑Ribose)Polymerase  Family Member 3)、 细胞表面跨膜蛋白CD34家族的成员P ODXL2 (Podocalyxin  Like2)、 细 胞周期依赖性激酶CDK1(Cyclin  Dependent Kinase 1)、 无机焦 磷酸盐运输调节因子ANKH(ANKH  Inorganic  Pyrophosphate Transport Regulator)、 膜 铁 转运辅助蛋白HEPHL1(Hephaestin  Like 1)和神经递质转运体SLC6A( Solute carrier  family 6)。权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114354936 A 23.生物标志物SIX2、 KLF9、 PARP3、 PODXL2、 CDK1、 ANKH、 HEPHL1或SLC6A在制备头颈鳞癌 患者临床应用西妥昔单抗疗效的预测试剂中的应用。 4.一种西妥昔单抗原发耐药生物标志物药效预测试剂 盒， 其至少包括基因表达检测探 针和/或拷贝数检测探针， 其中， 所述基因表达检测探针包括针对SIX2、 KLF9、 PARP3、 PODXL2 中的一者或多者的基因表达检测探针， 以及所述拷贝数检测探针包括针对CDK1、 ANKH、 HEPHL1、 SLC 6A中的一 者或多者的拷贝数检测探针。 5.根据权利要求4所述的试剂盒， 其中， 所述试剂盒还包括组织DNA提取试剂、 PCR逆转 录试剂、 引物探针 混合液、 Taqman拷贝数变异检测预混试剂、 qRT ‑PCR检测预混试剂、 阳性质 控品和无RNase 水。 6.根据权利要求4所述的试剂盒， 其中， 所述基因表达检测探针和拷贝数检测探针的5 ’ 端标记荧 光基团， 3 ’端标记淬灭基团。 7.根据权利要求4所述的试剂盒， 其中， CDK1、 ANKH、 HEPHL1、 SLC6A、 SIX2、 KLF9、 PARP3、 PODXL2检测探针序列包括： 8.一种试剂盒在制备头颈鳞癌患者西妥昔单抗原发耐药的预测制剂中的应用， 其中， 所述试剂盒含有SIX2、 KLF9、 PARP3、 PODXL2、 CDK 1、 ANKH、 HEPHL1、 SLC6A 检测试剂中的一种或 多种。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114354936 A 3