(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210030485.3 (22)申请日 2022.01.12 (71)申请人 天津市农业科 学院 地址 300192 天津市南 开区航天道 26号 (72)发明人 贲海燕　郝永娟　姚玉荣　霍建飞　 王万立　刘晓琳　 (74)专利代理 机构 北京中珒知识产权代理事务 所(特殊普通 合伙) 11806 代理人 王中 (51)Int.Cl. C12Q 1/6844(2018.01) C12Q 1/6895(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/645(2006.01) (54)发明名称 一种草莓白粉病菌LAMP可视化快速检测方 法及应用 (57)摘要 本发明公开了一种草莓白粉病菌LAMP可视 化快速检测方法及应用， 是以待检测样本的DNA 为模板， 利用引物进行LAMP反应扩增， 再通过实 时荧光扩增曲线和荧光染料目测观察法进行检 测。 引物包括1对外侧引物F3和B3， 1对内侧引物 FIP和BIP， 以及1对环引物LF和LB。 本发明的草莓 白粉病菌LAMP引物特异性强、 扩增效果好， 建立 了其快速、 简便、 特异性强、 灵敏度高的草莓白粉 病菌LAMP可视化检测体系， 可用于草莓白粉病植 株带菌组织及发病前期、 初期田间带菌检测， 并 且该方法具有检测时间短、 对操作人员要求低、 肉眼直接观察结果， 检测成本低等优点， 对于草 莓白粉病早期诊断、 监测， 提早预防、 确定最佳防 治时间具有重要的意 义。 权利要求书1页 说明书8页 序列表2页 附图5页 CN 114395617 A 2022.04.26 CN 114395617 A 1.一种草莓白粉病菌LAMP可视化快速检测方法， 其特征在于， 所述检测方法中的引物 包括1对外侧引物F3和B3， 1对内侧引物FIP和BIP， 以及1对环引物LF和LB， 序列如下 所示： F3:5’ ‑CGGTATTCCGAGGGGCAT‑3’， B3:5’ ‑CCTGATCCGAGGTCATCCAA‑3’， FIP:5’ ‑CTGTTTAGGGGACGCCGAGCTGT TCGAGCGTCAGA ACATC‑3’， BIP:5’ ‑GGCGGTACCGTTGTGCTCTCTAG GTGGGTTTTGGCAGGT‑3’， LF:5’ ‑ACCAAGCCAGGCTTGAGAG‑3’， LB:5’ ‑GTAGTCACGTATCTCGCGACAGAG ‑3’。 2.根据权利要求1所述的草莓白粉病菌LAMP可视化快速检测方法， 其特征在于， 包括以 下步骤： 以待检测样本的DNA为模板， 利用所述引物进行LAMP反应扩增， 再通过实时荧光扩 增曲线和/或荧 光染料目测观察法进行检测。 3.根据权利 要求2所述的草莓白粉病菌LAMP可视化快速检测方法， 其特征在于， LAMP反 应体系为： 10 ×Isothermal  Amplification  Buffer2.5μL、 8mmol/L的MgSO41.5μL、 1.6mmol/LdNTPs4.0 μL、 1.2mmol/L甜菜碱0.6 μL、 320u/mLBstDNA聚合酶1 μL， DNA模板2.0 μL， 钙黄绿素1μL、 1.6 μM的FIP和BIP各1μL， 0.2 μMF3和B3各1μL， 0.4 μM  LoopF和LoopB各1μL， 无 菌去离子水补足25 μL。 4.根据权利 要求2所述的草莓白粉病菌LAMP可视化快速检测方法， 其特征在于， LAMP反 应条件为： 6 5℃温育60min后， 80℃灭活5mi n。 5.根据权利要求2所述的草莓白粉病菌LAMP可视化快速检测方法， 其特征在于， 所述实 时荧光扩增曲线为： 在LAMP反应体系反应过程中， 每间隔1min读取一次荧光， 收集荧光信 号， 扩增曲线呈 “S”型为阳性， 未收集到扩增荧 光信号的呈直线型为阴性。 6.根据权利要求2所述的草莓白粉病菌LAMP可视化快速检测方法， 其特征在于， 荧光染 料目测观察法： 在LAMP反应体系中加入1μL钙黄绿素荧光染料， 反应结束后， 肉眼观察反应 液呈绿色荧 光的为阳性， 显橙色的为阴性。 7.根据权利要求1 ‑6任一所述的草莓白粉病菌LAMP可视化快速检测方法在草莓白粉病 菌诊断、 监测 和鉴定中的应用。 8.根据权利要求1 ‑6任一所述的草莓白粉病菌LAMP可视化快速检测方法在草莓白粉病 植株带菌组织及发病前期、 初期田间带菌检测中的应用。 9.根据权利要求1 ‑6任一所述的草莓白粉病菌LAMP可视化快速检测方法在转基因草莓 及其加工后产品的快速检测中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114395617 A 2一种草莓白粉病菌LAMP可视化快速检测方 法及应用 技术领域 [0001]本发明涉及草莓白粉病技术领域， 特别涉及一种草莓白粉病菌LAMP可视化快速检 测方法及应用。 背景技术 [0002]草莓白粉病是保护地草莓发病面积较大， 发病频率较高的草莓病害之一， 其病原 菌是子囊菌亚门真菌羽衣草单囊 壳菌(Sphaerotheca  aphanis)， 属于气传病害， 主要危害 草莓的叶片和果 实， 有时还会危害草莓的花梗和叶柄， 匍匐茎上很少发生， 草莓白粉病的发 生贯穿草莓生长的各个阶段， 多发于草莓生产旺季。 草莓白粉菌属于专 性寄生菌， 在 全世界 各地都有分布， 主要发生于气候条件相对寒冷的地区， 我国较为寒冷的华北平原发病较为 严重。 草莓白粉病一直是制约我国草莓产业的一大瓶颈， 近年来尤其是保护地草莓白粉病 对草莓果实和 植株产生极大影响， 甚至在栽培条件良好的大棚内往往更容易发病， 且一旦 发病， 整棚的草莓都可能感染， 采摘时由于发病症状不明显， 果实表面白粉菌数量太少， 有 些草莓虽然在采摘时没有发现染病情况， 但也会在货架期间的两到三天出现白粉病， 此时 的草莓不宜出售。 病果率超过50％， 病叶率超 过45％， 草莓的品质变 劣， 果实表面失去光泽， 草莓产量下降， 给种植农户带来极大的经济损失。 适宜采摘的 “红颜”、“章姬”等品种对草莓 白粉病较为敏感； 防治技术不到位， 农户单一频繁使用几种药剂， 导致病菌抗药性较高。 果 实上的白粉病病原菌较叶片更难防治， 于是生产上 “保险药”频繁使用， 草莓安全生产受到 了威胁。 [0003]目前草莓白粉病最主要防治手段仍然是喷施化学农药， 但随着施药量的增加， 出 现了果实品质下降、 环境污染、 病菌抗性产生等一系列问题。 及时、 准确预测白粉病的发生 时期、 流行强度， 确定药剂使用时期、 次数和剂量能够提高药效、 减少施药次数、 降低生产成 本、 减轻环境污染等因农药使用所带来的负面影响， 为白粉病的综合防治提供依据。 因此， 开展草莓白粉病预测预报研究对于科学防治草莓白粉病 具有重要的意义。 目前， 还没有草 莓白粉病快速检测技术的报道， 因此， 建立高效、 快速的早期 检测技术将为草莓白粉病的科 学防控提供新的思路， 推动草莓产业的健康发展。 [0004]传统的白粉病早期检测方法往往根据病组织的症状、 病原菌的特征以及研究人员 的经验进 行识别， 但是白粉病引起的早期退绿与其他病原引起的症状相似， 很难准确判断。 另一方面， 白粉病是专性寄生菌， 不能进行人工培养， 因此不能单靠传统的分离培养、 血清 鉴定和EL ISA等方法进行检测难度较大。 [0005]环介导等 温扩增(loop ‑mediated  isothermal  amplification， LAMP)是2000年日 本学者Notomi 公开发表的一种新型核酸扩增技术， 其能够识别靶序列上6个特异区域的4条 正反向外引物和正反向内引物， 在60 ‑65℃恒温条件下， 利用高活性链置换DNA聚合酶， 特 异、 高效地扩增靶基因。 该技术的灵敏度是普通PCR的100倍， 并且15 ‑60min即可实现目标基 因高效扩增。 LAMP反应产物不仅可以通过浊度仪、 real ‑time PCR仪及凝胶电泳仪进行检 测， 而且还 可以通过SYBR  GreenⅠ、 钙黄绿素、 羟基萘酚蓝染色后肉眼识别。 由于LAMP反应简说　明　书 1/8 页 3 CN 114395617 A 3