(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210032138.4 (22)申请日 2022.01.12 (71)申请人 中国农业科 学院郑州果 树研究所 地址 450000 河南省郑州市管城回族区南 曹乡安徐庄 (72)发明人 周丹　韩小旭　马双武　王吉明　 尚建立　李娜　 (74)专利代理 机构 郑州豫乾知识产权代理事务 所(普通合伙) 41161 代理人 高娇娜 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6869(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 西瓜叶片黄化致死主效基因及鉴定该主效 基因的dCAP S分子标记和应用 (57)摘要 西瓜叶片黄化致死主效基因及鉴定该主效 基因的dCAPS分子标记和应用， 涉及生物技术领 域。 公开了与西瓜叶片黄化致死基因紧密连锁的 SNP位点， SNP位点位于西瓜基因组1号染色体 34859242bp位置， 碱基变化为T →C， 通过在F2群 体以及资源群体的验证， 表明该dCAPS分子标记 可有效鉴定西瓜黄化致死这一性状， 本发明方法 可快速、 精准定位西瓜黄化致死性状基因， 为西 瓜种质资源叶片黄化突变类型鉴定和分子标记 辅助育种研究提供新手段。 权利要求书1页 说明书8页 序列表1页 附图2页 CN 114381544 A 2022.04.22 CN 114381544 A 1.西瓜叶片黄化致死主效基因， 其特征在于， 包括与西瓜叶片黄化致死基因紧密连锁 的SNP位点， 所述SNP位 点位于西瓜 基因组1号染色体34859 242bp位置， 碱基 变化为T→C。 2.鉴定权利要求1所述西瓜叶片黄化致死主效基因的dCAPS分子标记， 其特征在于， 利 用所述SNP位 点开发的dCAP S分子标记， 所述dCAP S分子标记的引物对为: ed‑F:5’ ‑ATGGATCTTTTCTAAGACCA‑3’。 ed‑R:5’ ‑GATTGAGAGGAGACATAGTG ‑3’。 3.根据权利要求2所述dCAPS分子标记， 其特征在于， 所述dCAPS分子标记开发的步骤 为： (1)选取供试西瓜材 料， 所述供 试西瓜材 料包括母本、 父本、 F1、 F2群 体以及资源群 体； (2)确定所述供 试西瓜材 料中的叶片黄化 致死植株、 叶片黄绿植株、 叶片正常绿植株； (3)将F2群体中的叶片正常绿叶和叶片黄绿中间类型植株构建极端混池， 进行混池测 序， 并以黄化致死材料为母本， 以正常绿叶材料为父本进行亲本重测序， 利用测序信息筛选 目标变异位 点， 获得候选SNP位 点； (4)在所述父本、 母本、 F1和F2群体中验证所述候选SNP位点， 并结合资源群体验证分 析， 获得与西瓜叶片黄化 致死基因紧密连锁的dCAP S标记。 4.根据权利 要求3所述的dCAPS 分子标记， 其特征在于， 步骤(1)中所述父本为叶片正常 绿西瓜材料； 所述母本为叶片黄化致死西瓜材料； 所述F1为所述父本和所述母本杂合的西 瓜材料； 所述F2群体为所述F1自交获得的西瓜材料； 所述资源群体为西甜瓜中期库核心种 质资源西瓜材 料。 5.根据权利 要求3所述的dCAPS 分子标记， 其特征在于， 步骤(2)中采用直接观察法确定 所述供试西瓜材 料中的叶片黄化 致死植株、 叶片黄绿植株、 叶片正常绿植株。 6.根据权利要求2所述的dCAPS 分子标记， 其特征在于， 采用所述dCAPS 分子标记鉴定西 瓜叶片黄化 致死基因的方法， 步骤为： (1)DNA的提取： 采用植物基因 组DNA提取 试剂盒提取西瓜叶片总DNA； (2)PCR扩增： 利用所述引物对ed ‑F、 ed‑R对待测样品进行PCR扩增； (3)酶切PCR产物： 利用限制性内切酶N laIII对扩增出的PCR产物进行酶切； (4)电泳图谱分析： 对上述酶切产物进行8％聚丙烯酰胺凝胶电泳、 显影、 染色和带型判 读， 得到135bp产物的是黄化致死植株， 得到115bp产物的是正常绿叶株， 同时得到135bp和 115bp两条 带产物的是叶片黄绿杂合株。 7.权利要求1所述西瓜叶片黄化致死主 效基因在鉴定西瓜种质资源叶片黄化突变类型 中的应用。 8.权利要求2所述dCAPS分子标记在快速、 精准定位西瓜黄化致死性状基因以及和分子 标记辅助育种中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114381544 A 2西瓜叶片黄化致死主 效基因及鉴定该主 效基因的dCAPS分子 标记和应用 技术领域 [0001]本发明涉及 生物技术领域， 具体涉及西瓜叶片黄化致死主效基因及鉴定该主效基 因的dCAP S分子标记和应用。 背景技术 [0002]西瓜作为为夏季水果之王， 深受人们的喜爱。 世界各地都有着广泛的栽培， 中国是 西瓜的生产和消费的第一大国。 西 瓜在长期的生产栽培过程中， 叶片颜色常常会发生突变， 一般表现为白化致死、 黄绿、 延迟变绿、 黄斑驳、 斑点等类型。 叶色突变体是研究光合作用、 叶绿素合成以及叶绿体发育的理想材 料， 同时也是遗传和育种研究中重要的基础材 料。 [0003]植物叶片颜色与叶绿素的生物合成过程紧密相关， 叶绿素的合成自谷氨酰 ‑tRNA 开始， 经过了19步反应， ， 期间由27个基因编码了15个酶参与， 最终生成叶绿素a、 叶绿素b。 在这些过程中， 任何一步出现问题都有可能对叶绿素 的合成产生影响， 从而导致叶色发生 变异。 如拟南芥中通过图位克隆验证乙烯原叶绿素酯8 –乙烯基还原酶基因(DVR)突变造成 黄绿叶表型； 黄瓜黄金叶(YP)突变体中发现编码镁螯合 酶的CHLI亚基保守序列发生单核苷 酸突变导致氨基酸替换和黄金叶表型。 可见同为叶色黄化突变体有时 我们并不能用肉 眼轻 易识别出是否受同一基因控制， 只能在分子水平上对突变基因进 行鉴定， 并挖掘基因功能， 培育高光效植物， 进行分子 辅助育种。 [0004]西瓜叶色突变体在20世 纪80年代就有报道， 如 黄叶Yl基因； 幼龄白化基因ja； 苍白 叶色基因pl； 叶片后绿基因dg及黄斑点基因Sp等， 但是大部分停留在表型观 察、 遗传分析以 及生理特性研究上， 将叶色突变定位到染色体 基因上的却很少。 发明内容 [0005]为解决现有技术中存在的问题， 本发明提供了一个西瓜叶片黄化致死主效基因以 及一种鉴定该基因的dCAPS分子标记方法， 可快速、 精准定位西瓜黄化致死性状基因， 为西 瓜种质资源黄化突变类型 的鉴定和分子标记辅助育种的研究提供新手段， 具体地， 通过以 下技术方案实现： [0006]西瓜叶片黄化致死主效基因， 包括与西瓜叶片黄化致死基因(简称ed基因)紧密连 锁的SNP位 点， 所述SNP位 点位于西瓜 基因组1号染色体34859 242bp位置， 碱基 变化为T→C。 [0007]鉴定西瓜叶片黄化致死主效基因的dCAPS分子标记， 利用SNP位点开发的dCAPS分 子标记， dCAP S分子标记的引物对为: [0008]ed‑F:5’ ‑ATGGATCTTTTCTAAGACCA‑3’。 [0009]ed‑R:5’ ‑GATTGAGAGGAGACATAGTG ‑3’。 [0010]优选地， dCAP S分子标记开发的步骤为： [0011](1)选取供试西瓜材 料， 供试西瓜材 料包括母本、 父本、 F1、 F2群 体以及资源群 体； [0012](2)确定供 试西瓜材 料中的叶片黄化 致死植株、 叶片黄绿植株、 叶片正常绿植株；说　明　书 1/8 页 3 CN 114381544 A 3