(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210033141.8 (22)申请日 2022.01.12 (71)申请人 西北农林科技大 学 地址 712100 陕西省咸阳市杨凌区 邰城路3 号 (72)发明人 龚春梅　李佳阳　任洁洁　珠拉太　 周文菲　唐磊　余有本　白娟　 周杰　王文钊　 (74)专利代理 机构 北京慕达星云知识产权代理 事务所 (特殊普通合伙) 11465 专利代理师 崔自京 (51)Int.Cl. C12N 15/10(2006.01) C12Q 1/686(2018.01)C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种快速高效的DNA 5 ’侧翼序列克隆方法 (57)摘要 本发明公开了一种快速高效的DNA5 ’侧翼序 列克隆方法， 包括以下2个主要步骤： (1)待测样 本为模板， 通过不同LAD引物组合与基因特异性R 引物配对， 使用热不对称交错PCR的方法进行第 一轮PCR扩增； (2)以不同稀释倍数的第一轮PCR 扩增产物作为模板， 结合巢式PCR的引物设计方 法， 使用通用引物AC1与设计在第1轮特异性R引 物上游的不同基因特异性R引物配对， 通过热不 对称交错PCR的方法进行第二轮PCR扩增。 配合判 断方法能够快速鉴别正确扩增条带范围， 在原 HiTail‑PCR的基础上由3轮扩增缩减为2轮扩增， 且可由特异引物之间的已知间隔距离快速锁定 特异扩增并排除部分非特异扩增， 大幅减少非特 异扩增带来的干 扰。 权利要求书1页 说明书8页 序列表3页 附图3页 CN 114540341 A 2022.05.27 CN 114540341 A 1.一种快速高效的DNA  5’侧翼序列克隆方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： (1)以待测样本为模板， 使用LAD引物组分别与S P1引物进行 热不对称PCR扩增； 所述LAD引物组至少需要4个LAD引物， 且两 两配对； (2)将(1)中扩增产物为模板， 使用AC1依次与其 余SP引物进行 热不对称PCR扩增； 所述SP引物组需要设计至少2个S P引物进行2组及以上扩增。 2.如权利 要求1所述的快速高效的DNA  5’侧翼序列克隆方法， 其特征在于， 还包括特异 性扩增条带的判断： 步骤(2)中AC1与SP的扩增产物， 若不同组合扩增出大小相同的条带， 则 一定为非特异扩增。 3.如权利 要求1所述的快速高效的DNA  5’侧翼序列克隆方法， 其特征在于， 步骤(2)中， 所述(1)中扩增产物为稀释10 ‑50倍的扩增产物。 4.一种如权利要求1 ‑3任一所述的侧 翼序列克隆方法在制备侧翼序列 克隆制剂中的应 用。 5.一种侧 翼序列克隆引物 组， 其特征在于， 包括： 即针对物种特异型设计的一系列SP引 物组。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114540341 A 2一种快速 高效的DNA 5’侧翼序列克隆方 法 技术领域 [0001]本发明属于侧翼序列克 隆技术领域， 具体涉及一种快速高效的DNA  5’侧 翼序列 克隆方法。 背景技术 [0002]染色体步移技术(Genome  Walking)是一种重要的分子生物学研究技术，  使用这 种技术可以有效获取与已知序列相邻的5 ’端未知序列。 染色体步移技术  主要有以下几方 面的应用： [0003]1.根据已知的基因或分子标记连续步移， 获取人、 动物和植物的重要调控基  因， 可以用于研究结构基因的表达调控。 如分离克隆启动子并对其功能进行研  究； [0004]2.获取新物种中基因的非保守区域， 从而获得完整的基因序列； [0005]3.鉴定T‑DNA或转座子的插入位点， 鉴定基因枪转基因法等转基因技术所导  致的 外源基因的插 入位点等； [0006]4.用于染色体测序工作中的空隙填补， 获得完整的基因 组序列； [0007]5.用于人工染色体PAC、 YAC和BAC的片段 搭接。 [0008]对于基因组测序已经完成的少 数物种来说， 可以轻松地从数据库中找到某  物种 已知序列的侧翼序列。 但是， 对于大多数基因组信息未知的生物而言， 想  要知道一个已知 区域5’端的DNA序列， 只能采用染色体步移技 术。 [0009]由于染色体步移使用AP引物的局限性， 在每一轮扩增中， 均可能产生较短  或者新 的非特异扩增， 通过巢式PCR的方法不能完全消除非特异扩增结果。 针对  上述问题， Liu和 Chen发明了HiTail ‑PCR的方法， 很大程度上消除了特异性短片  段的扩增和部分非特异扩 增(Liu YG,Chen Y.High‑efficiency  thermal asymme tric  interlaced  PCR for  amplification  of unknown flanking  sequences.BioTechn iques,2007,43(5):649 ‑ 650,652,654passim.)。 尽管HiTail ‑PCR技术的出现弥  补了普通染色体步移的部分缺陷， 但是仍旧存在效率 不高及步骤繁琐的问题。 [0010]因此， 如何提供一种快速高效的DNA  5’侧翼序列克 隆方法是本领域亟待  解决的 问题。 发明内容 [0011]本发明公开了一种快速高效的DNA  5’侧翼序列克隆方法。 [0012]为了实现上述目的， 本发明采用如下技 术方案： [0013]一种快速高效的DNA  5’侧翼序列克隆方法， 包括以下步骤： [0014](1)以待测样本为模板， 使用LAD引物组分别与S P1引物进行 热不对称P  CR扩增； [0015]所述LAD引物组至少需要4个LAD引物， 且两 两配对； [0016](2)将(1)中扩增产物为模板， 使用AC1依次与其 余SP引物进行 热不 对称PCR扩增； [0017]所述SP引物组需要设计至少2个S P引物进行2组及以上扩增；说　明　书 1/8 页 3 CN 114540341 A 3