(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210038957.X (22)申请日 2022.01.13 (71)申请人 江苏省家禽科 学研究所 地址 225100 江苏省扬州市邗江区仓颉路 58号 (72)发明人 陶志云　李慧芳　章双杰　徐文娟　 宋卫涛　朱春红　刘宏祥　王志成　 (74)专利代理 机构 北京精翰专利代理有限公司 11921 代理人 卓邦荣 (51)Int.Cl. C12Q 1/6888(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12Q 1/6869(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种与鸭产蛋性状相关的分子标记组合、 获 得方法及应用 (57)摘要 本发明提供一种与鸭产蛋性状相关的分子 标记组合、 获得方法及应用， 涉及水禽分子生物 技术领域。 从母鸭基因组中扩增Z号性染色体， 测 序获得一种作为金定鸭产蛋性状相关的纯和的 分子标记组合， 该分子组合涉及三段产蛋性状相 关的基因片段， 其核苷酸序列分别如序列表SEQ   ID NO.1， SEQ  ID NO.2和SEQ  ID NO.3所示， 分子 标记为SEQ  ID NO.1的第81bp处发生A81G的碱基 突变， SEQ  ID NO.2的第80bp处发生G80A的碱基 突变， SEQ  ID NO.3的第 127bp处发生A127G的碱 基突变。 通过该分子标记组合能够为金定鸭产蛋 性能的早期选育提供一种快速、 简便、 价格低廉 的基因分析方法， 有利于筛选出产蛋性能相对较 好的金定鸭个体， 指导金定鸭产蛋性能早期分子 标记辅助选 育。 权利要求书2页 说明书5页 附图1页 CN 114317776 A 2022.04.12 CN 114317776 A 1.一种与鸭产蛋性状相关的分子标记组合， 分别位于鸭Z号染色体40062944， 24633879 及24697431bp位， 对应基因RORb的内含子1的第50630位核苷酸A →G的突变， 基因ARSB的内 含子1的第2330位核苷酸G →A突变和外显子8的第65882bp位核苷酸A →G的突变,作为金定 鸭早期产蛋性状相关分子标记的应用， 其特征在于， 所述分子标记的核苷酸序列为SEQ  ID  NO.1， SEQ  ID NO.2和SEQ ID NO.3所示， 在SEQ  ID NO.1的第81bp处发生A81G的碱基突变， SEQ ID NO.2的第80bp处发生 G80A的碱基突变， SEQ  ID NO.3的第127bp处发生A127G的碱基 突变。 2.根据权利要求1所述RORb， ARSB基因的分子标记组合进行金定鸭产蛋性能早期快速 选育方法， 其特征在于， 检测RORb和ARSB基因的SNP位点， 即SEQ  ID NO.1的第81bp是否发生 A81G的碱基突变,SEQ  ID NO.2的第80bp处是否发生G80A的碱基突变， SEQ  ID NO.3的第 127bp处是否发生A127G的碱基突变作为选 育条件。 3.根据权利 要求2所述的利用RORb和ARSB基因的分子标记组合进行金定鸭产蛋性能早 期快速选育方法， 其特征在于， 检测RORb和ARSB基因的SNP位点， 即SEQ  ID NO.1的第81bp是 否发生A8 1G的碱基突变,SEQ  ID NO.2的第80bp处是否发生G80A的碱基突变， SEQ  ID NO.3 的第127bp处是否发生A127G的碱基突变所采用的步骤 包括： 1)样本基因 组DNA提取； 2)样本质量检测； 3)多重PCR； 4)二代测序的方法对 扩增子进行高通 量测序； 5)对测序结果使用生物信息学 方法， 区分不同的样本， 最终 获得每个位点的突变信息 。 4.根据权利要求3所述的利用RORb和ARSB基因的分子标记组合进行快速选育方法， 其 特征在于， 该方法所用的样 本为鸭的血液样本， 对二轮扩增获得的产 物进行混样， 对混样后 的文库进 行纯化， 对 纯化产物精确定量并稀释 至测序所需浓度(10ng/ μL)， 高通量测序由上 海翼和生物有限公司采用Illumina  X‑10测序平台测序完成， 采用生物信息学的方法， 对三 个突变位 点的信息进行分类汇总， 获得每 个样本每 个突变位 点的信息 。 5.根据权利要求4所述的利用RORb和ARSB基因的分子标记组合进行快速选育方法， 所 用的鸭血样样本的基因组DNA提取， 其提取采用天跟生化科技(北京)有限公司血液基因组 DNA提取系统(0.1 ‑20mL)(天根 生物， DP349)。 6.根据权利要求3所述的利用RORb和ARSB基因的分子标记组合进行快速选育方法， 其 特征在于， 采用琼脂糖凝胶电泳和 生物风光光度计检测样本质量， 琼脂糖凝胶电泳检测有 目的条带， 拖带不明显， 生物风光光度计检测DNA浓度在2 0ng/ μL,OD260/280和OD2 60/230在 1.8‑2.0之间的判定为 合格样本 。 7.根据权利要求3所述的利用RORb和ARSB基因的分子标记组合进行快速选育方法， 其 特征在于， 该 方法所用的PCR扩增引物组合 为： 上游引物序列1： 5 ’ ‑ttgatatgacactaca acagttcc‑3’， (SEQ ID NO.4) 下游引物序列1： 5 ’ ‑ctggtttttctccctcttaaatt‑3’， (SEQ ID NO.5) 上游引物序列2： 5 ’ ‑agagtactgca aaaatagctttcc‑3’,(SEQ ID NO.6) 下游引物序列2： 5 ’ ‑aaaagcctaacaggtaacaactac‑3’,(SEQ ID NO.7) 上游引物序列3： 5 ’ ‑ttcgtgatcctgaagagaaaaatg‑3’,(SEQ ID NO.8)权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114317776 A 2上游引物序列3:5 ’ ‑tacataaaatgaactctgctgca g‑3’。 (SEQ ID NO.9) 根据权利要求3所述的利用RORb和ARSB基因的分子标记组合进行快速选育方法， 其特 征在于， 多重PCR扩增： 第一轮PCR配置方法为， 三对引物工作液配制PCR  mix， 分装于每个个 体相对应的96孔板中， 取样 本板充分解冻、 震荡， 1000rpm离心1s后进行加样， 加样时每板预 留2个孔， 分别加入阳性及阴性对照， 一轮扩增体系为Primer(50nM)2 μL， dNTP(2.5mM)0.8 μ L， Taq酶(5U/ μL)0.1 μL， 10X  buffer 1 μL， 基因组DNA(20ng/ μL)2 μL， Mg2+(100mM)1 μL， 石蜡油 10 μL， ddH2O 3.2 μL， 共计20 μL。 8.根据权利要求8所述的利用RORb和ARSB基因的分子标记组合进行快速选育方法， 需 进行多重PCR扩增， 其特征在于， 第一轮PCR反应条件如下： ①95℃15min， 1cycle； ②94℃ 30s， 60℃10min， 4cycles； ③94℃30s， 60℃1min， 72℃30s， 20cycles。 9.根据权利要求3所述的利用RORb和ARSB基因的分子标记组合进行快速选育方法， 需 进行多重PC R扩增， 其特征在于， 第二轮PCR扩增体系如下， 一轮产物每孔加ddH2O 100 μL， 瞬 时离心， 室温静置10min， 以稀释液作为二轮扩增模板， 扩增体系Barcode(2 μM)3.6 μL， dNTP (2.5mM)0.8 μL， Taq酶(5U/ μL)0.1 μL， 一轮产物样本10 μL， Mg2+(100mM)1 μL， 10X  buffer 2 μL， ddH2O 3.6 μL， 石蜡油20ul， 总体系40 μL。 10.根据权利要求10所述的利用RORb和ARSB基因的分子标记组合进行快速选育方法， 需进行多轮PCR扩增， 其特征在于， 第二轮PCR扩增反应条件为： ①95℃15min， 1cycle； ②94 ℃30s， 60℃4min， 5cycles；③94℃30s， 65℃1min， 72℃30s， 10cycles。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114317776 A 3