(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210035171.2 (22)申请日 2022.01.13 (71)申请人 上海市动物疫病预防控制中心 （上 海市兽药饲料检测所、 上海市畜牧 技术推广中心） 地址 201103 上海市长 宁区虹井路85 5弄30 号 (72)发明人 王晓旭　王建　赵洪进　徐锋　 沈莉萍　齐新永　赵晓明　杨德全　 唐聪圣　张玉杰　 (74)专利代理 机构 上海骁象知识产权代理有限 公司 31315 代理人 林炜 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01)C12Q 1/6844(2018.01) C12Q 1/14(2006.01) C12Q 1/10(2006.01) C12Q 1/04(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种用于检测奶牛乳房炎致病菌的试剂盒 及其方法 (57)摘要 本发明提供了一种用于检测奶牛乳房炎致 病菌的试剂盒， 包括扩增金黄色葡萄球菌的引 物、 扩增表皮葡萄球菌的引物、 扩增无乳链球菌 的引物、 扩增停乳链球菌的引物、 扩增乳房链球 菌的引物、 扩增肠球菌的引物、 扩增铜绿假单胞 菌的引物、 扩增肠杆菌的引物、 扩增大肠埃希菌 的引物、 扩增肺炎克雷伯菌的引物、 扩增单增李 斯特菌的引物和扩增牛支原 体的引物。 本发明还 提供了采用上述的试剂盒检测奶牛乳腺炎的方 法。 本发明的方法具有操作便捷、 无需特殊仪器、 成本低廉的特点， 不仅能为养殖场的准确诊疗提 供强有力的帮助， 而且其检测 效率高、 成本低廉 的特点也非常适合基层使用， 具备大规模推广应 用的条件。 权利要求书2页 说明书8页 序列表8页 附图2页 CN 114277169 A 2022.04.05 CN 114277169 A 1.一种用于检测奶牛乳房炎致病菌的试剂盒， 其特征在于： 包括扩增金黄色葡萄球菌 的引物、 扩增表皮葡萄球菌的引物、 扩增无乳链球菌的引物、 扩增停乳链球菌的引物、 扩增 乳房链球菌的引物、 扩增肠球菌的引物、 扩增铜 绿假单胞菌的引物、 扩增肠杆菌的引物、 扩 增大肠埃希菌的引物、 扩增肺炎克雷伯菌的引物、 扩增单增李斯特菌的引物和扩增牛支原 体的引物； 用于检测金黄色葡萄球菌的上游内引物FIP如SEQ  ID NO.1所示； 用于检测金黄 色葡萄球菌的下游内引物BIP如SEQ  ID NO.2所示； 用于检测金黄 色葡萄球菌的上游外引物 F3如SEQ ID NO.3所示； 用于检测金黄色葡萄球菌的下游外引物B3如SEQ  ID NO.4所示； 用 于检测表皮葡萄球菌的上游内引物FIP如SEQ  ID NO.5所示； 用于检测表皮葡萄球菌的下游 内引物BIP  如SEQ ID NO.6所示； 用于检测 表皮葡萄球菌的上游外引物F如SEQ  ID NO.7所 示； 用于检测表皮葡萄球菌的下游外引物B3如S EQ ID NO.8所示； 用于检测无乳链球菌的上 游内引物FIP： 如SEQ  ID NO.9所示； 用于检测无乳链球菌的下游内引物BIP:  如SEQ ID  NO.10所示； 用于检测无乳链球菌的上游外引物F3： 如SEQ  ID NO.11所示； 用于检测无乳链 球菌的下游外引物B3如SEQ  ID NO.12所示； 用于检测停乳链球菌的上游内引物FIP： 如SEQ   ID NO.13所示； 用于检测停乳链球菌的下游内引物BIP如SEQ  ID NO.14所示； 用于检测停乳 链球菌的上游外引物F3如SEQ  ID NO.15所示； 用于检测停乳链球菌的下游外引物B3如SEQ   ID NO.16所示； 用于检测乳房链球菌的上游内引物FIP如SEQ  ID NO.17所示； 用于检测乳房 链球菌的下游内引物BIP如SEQ  ID NO.18所示； 用于检测乳房链球菌的上游外引物F3如SEQ   ID NO.19所示； 用于检测乳房链球菌的下游外引物B3如SEQ  ID NO.20所示； 用于检测肠球 菌的上游内引物FIP如SEQ  ID NO.21所示； 用于检测肠球菌的下游内引物BIP如SEQ  ID  NO.22所示； 用于检测肠球菌的上游外引物F3如SEQ  ID NO.23所示； 用于检测肠球菌的下游 外引物B3如SEQ  ID NO.24所示； 用于检测铜绿假单胞菌的上游内引物FIP如SEQ  ID NO.25 所示； 用于检测铜绿假单胞菌的下游内引物BIP如SEQ  ID NO.26所示； 用于检测铜绿假单胞 菌的上游外引物F3如SEQ  ID NO.27所示； 用于检测 铜绿假单胞菌的下游外引物B3如SEQ  ID  NO.28所示； 用于检测肠杆菌的上游内引物FIP如SEQ  ID NO.29所示； 用于检测肠杆菌的下 游内引物BIP如SEQ  ID NO.30所示； 用于检测肠杆菌的上游外引物F3如SEQ  ID NO.31所示； 用于检测肠杆菌的下游外引物B3如S EQ ID NO.32所示； 用于检测大肠埃希菌的上游内引物 FIP如SEQ  ID NO.33所示； 用于检测大肠埃希菌的下游内引物BIP如SEQ  ID NO.34所示； 用 于检测大肠埃希菌的上游外引物F3如SEQ  ID NO.35所示； 用于检测大肠埃希菌的下游外引 物B3如SEQ  ID NO.36所示； 用于检测肺炎克雷伯菌的上游内引物FIP如SEQ  ID NO.37所示； 用于检测肺炎克雷伯菌的下游内引物BIP如SEQ  ID NO.38所示； 用于检测肺炎克雷伯菌的 上游外引物F3如SEQ  ID NO.39所示； 用于检测肺炎克雷伯菌的下游外引物B3如SEQ  ID  NO.40所示； 用于检测单增李斯特菌的上游内引物FIP如SEQ  ID NO.41所示； 用于检测单增 李斯特菌的下游内引物BIP如SEQ  ID NO.42所示； 用于检测单增李斯特菌的上游外引物F3 如SEQ ID NO.43所示； 用于检测单增李斯特菌的下游外引物B3如SEQ  ID NO.44所示； 用于 检测牛支原体的上游内引物FIP如SEQ  ID NO.45所示； 用于检测牛支原体的下游内引物BIP 如SEQ ID NO.46所示； 用于检测牛支原体的上游外引物F3如SEQ  ID NO.47所示； 用于检测 牛支原体的下游外引物B3如SEQ  ID NO.48所示。 2.根据权利要求1所述的一种用于检测奶牛乳房炎致病菌的试剂 盒， 其特征在于： 还包 括2×Lamp PCR Master Mix、 Bst 3.0DNA聚合酶、 钙黄绿素 ‑Mn 2+混合溶液和ddH2O。权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114277169 A 23.采用权利要求1所述的试剂盒检测奶牛乳腺炎的方法， 其特 征在于包括如下步骤： 1)提取奶牛乳汁样本， 加入到含有权利要求1试剂盒引物的LAMP反应体系中64℃恒温 反应1小时； 2)反应后判断结果： 反应后体系中钙黄绿素MnCL2混合溶液由棕黄色变为绿色荧光， 表 示存在与引物对相对应的致病菌； 反应前后没有颜色变化均为棕黄色， 表示没有与该引物 对相对应的致病菌的存在。 4.根据权利要求3所述的测奶牛乳腺炎的方法， 其特征在于包括如下步骤：  在所述的 LAMP反应体系中， 含有引物FIP和BIP  分别为0.8uM、 引物F3和B3分别为0.2uM， MgCl2 6mM， 10x反应缓冲液2.5ul， 钙黄绿素MnCl2溶液2.5ul， dNTP1mM， ddH2O 2ul， Bst DNA聚合酶320U/   ML。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114277169 A 3