(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210037042.7 (22)申请日 2022.01.13 (71)申请人 华中农业大 学 地址 430070 湖北省武汉市洪山区狮子山 街1号 (72)发明人 郝秀丽　黄巧云　陈雯莉　朱姣姣　 (74)专利代理 机构 武汉智嘉联合知识产权代理 事务所(普通 合伙) 42231 专利代理师 徐绍新 (51)Int.Cl. C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/6806(2018.01) C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01) (54)发明名称 一种高通量qPCR芯片及其在检测微生物重 金属抗性基因中的应用 (57)摘要 本发明公开了一种高通量qPCR(HT ‑qPCR)芯 片， 该芯片 含有能检测微生物重金属抗性基因的 引物集， 本发明针对环境中常见的9种重金属 (Cu、 Ag、 Hg、 Cr、 Zn、 Pb、 Ni、 Co、 C d)共设计了57个 相关抗性基因的引物集。 通过验证， 该芯片覆盖 范围广， 特异性好， 灵敏度高， 重复性强， 数据可 靠， 可成功 应用于环境样品中的微生物重金属抗 性基因检测和研究， 该芯片还具有可精确定量、 高通量、 成本低等优点， 是研究环境中重金属抗 性组的可靠 手段。 权利要求书6页 说明书16页 附图3页 CN 114525276 A 2022.05.24 CN 114525276 A 1.一种高通量qPCR芯片， 其特征在于， 所述高通量qPCR芯片含有能检测微生物重金属 抗性基因的引物集， 所述引物的设计步骤如下： 1)功能基因检索及序列下载： 针对Cu、 Ag、 Hg、 Cr、 Zn、 Pb、 Ni、 Co、 Cd九种重金属， 参考文 献报道， 搜集相关微生物抗性基因及其对应功能， 通过公共 数据库， 检索、 收集、 统计序列信 息并下载相关基因及蛋白序列； 2)系统发育树构建： 在MEGA ‑X 10.1软件中导入目标基因序列， 使用Clustal  W进行序 列比对并构建系统发育树； 3)CODEHOP设计简并引物： 根据系统发育树的亲缘关系， 对序列进行分簇， 通过Base ‑ By‑Base软件上传比对序列， 设置相应参数设计引物， 对CODEHOP生 成的引物 集进行筛选， 筛 选标准如下： (i)非简并5'区： 引物长度为18 ‑24个碱基， 预计退火温度为60℃； (ii)简并3' 区： GC含量为40％～60％， 核心区简并度最大为256， 至少含有4个氨基酸序列连续保守； (iii)其它参数： 扩增子 长度为120～40 0个碱基， 引物得分在6 0分以上。 2.如权利要求1所述的高通量qPCR芯片， 其特征在于， 共得到57个微生物抗性基因， 所 述基因及其对应功能为： 权　利　要　求　书 1/6 页 2 CN 114525276 A 23.如权利 要求2所述的高通量qPCR芯片， 其特征在于， 针对所述57个微生物抗性基因共 获得87对引物， 其中9对 是已知的应用于环境样品研究 的重金属抗性基因引物， 这87对引物 序列及其片段长度如下： 权　利　要　求　书 2/6 页 3 CN 114525276 A 3