(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210037761.9 (22)申请日 2022.01.13 (71)申请人 吉林大学 地址 130012 吉林省长 春市前进大街269 9 号 (72)发明人 赵魁　王帅　何师师　方梓煜　 周艳龙　关继羽　陆慧君　吕品　 徐梦实　贺文琦　高丰　 (74)专利代理 机构 天津市尚文知识产权代理有 限公司 12 222 代理人 黄静 (51)Int.Cl. C12N 7/04(2006.01) C12N 15/39(2006.01) C12N 15/85(2006.01)A61K 39/275(2006.01) A61P 31/20(2006.01) C12Q 1/70(2006.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 一种羊传染性脓疱病毒减毒株的制备方法 及其应用 (57)摘要 本发明提供了一种羊传染性脓疱病毒减毒 株的制备方法， 将羊传染性脓疱病毒毒力基因突 变失活， 所述毒力基因突变为 ORFs 120/121双基 因突变。 缺失ORFs  120/121基因后ORFV的致病性 显著降低。 本发明通过敲 除ORFV‑SY17毒株ORFs   120/121基因获得双基因缺失的羊传染性脓疱病 毒减毒株， 具备作为制备羊传染性脓疱病基因缺 失减毒活疫苗生产毒株的潜在应用价值。 缺失的 ORFs 120/121基因也可作为标志基因， 建立用于 ORFV疫苗毒和野 毒检测的鉴别诊断方法。 权利要求书1页 说明书7页 序列表5页 附图4页 CN 114350623 A 2022.04.15 CN 114350623 A 1.一种羊传染性脓疱病毒减毒株的制备方法， 将羊传染性脓疱病毒毒力基因突变失 活， 其特征在于， 所述毒力基因突变为ORFs  120/121双基因突变。 2.如权利 要求1所述的制备方法， 其特征在于， 所述毒力基因突变ORFs  120/121双基因 缺失突变。 3.如权利要求2所述的制备方法， 其特征在于， 所述羊传染性脓疱病 毒为羊传染性脓疱 病毒ORFV ‑SY17株。 4.如权利要求3所述的制备方法， 其特征在于， 缺失的ORFs  120/121基因序列包括如 SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。 5.如权利要求4所述的制备方法， 其特征在于， 所述ORFs  120/121双基因缺失突变为 ORFV‑SY17株全长序列的1207 79至122185位核苷酸 缺失突变。 6.如权利要求5所述的制备 方法， 其特 征在于， 具体包括以下步骤： 步骤1： 准备亲本毒株， 所述亲本毒株为羊传染性脓疱病毒ORFV ‑SY17株， 全长基因序列 如GenBan k： MG712417.1所述； 步骤2： 同源重组穿梭质粒的构建： 分别扩增ORFV ‑SY17株的ORFs  120/121基因两侧的 序列作为重组同源臂， 克隆至pUC57 ‑vv7.5‑eGFP筛选表达盒上， 获得携带标记基因eGFP的 pUC57‑LFΔORFs120 /121‑eGFP‑RFΔORFs  120/121重组穿梭质粒； 步骤3： 利用步骤2制备的pUC57 ‑LFΔORFs  120/121‑eGFP‑RFΔORFs  120/121质粒DNA 转染已感染ORFV ‑SY17野毒株的OFTu细胞， 通过荧光斑法和有限稀释法获得表达绿色荧光 蛋白的缺失病毒ORFV ‑SY17ΔORFs  120/121‑eGFP； 步骤4： 将ORFV ‑SY17ΔORFs  120/121‑eGFP作为候选毒株， 敲除GFP， 制备得到羊传染性 脓疱病毒ORFs120 /121双基因缺失毒株。 7.如权利要求6所述的制 备方法， 其特征在于， ORFs  120/121基因两侧的左、 右重组同 源臂序列如SEQ  IDNO.2和SEQ  ID NO.3所示。 8.如权利要求7所述的制备方法， 其特征在于， 利用PCR扩增所述重组同源臂， PCR扩增 的引物序列如SEQ  ID NO.4～7所示。 9.权利要求1至8任一项所述的制备方法在制备羊传染性脓疱病基因缺失减毒活疫苗 中的应用。 10.一种利用SEQ  ID NO.8和SEQ  ID NO.9所示的引物序列对ORFV基因缺失减毒疫苗株 免疫羊和自然感染ORFV野毒株病羊的鉴别和诊断方法， 其特征在于， 所述疫苗毒株免疫羊 由权利要求1至9任一项所述的制备方法制备获得的缺失ORFs  120/121基因的羊传染性脓 疱病毒减毒株进行免疫获得。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114350623 A 2一种羊传染性脓疱病毒减毒株的制备方 法及其应用 技术领域 [0001]本发明涉及 兽医领域， 具体涉及一种荧光标记的羊传染性脓疱病毒双基 因缺失毒 株的制备 方法及其应用。 背景技术 [0002]羊传染性脓疱病俗称 “羊口疮(Orf) ”， 是由羊传染性脓疱病毒(Orf  virus,ORFV) 感染引起绵羊、 山羊等的一种急性、 高度接触性的人兽共患传染病。 该病 是羊群常发疫病， 主要危害3～6月龄羔羊， 造成其生长/繁殖性能的下降甚至死亡， 给我国乃至世界养羊业造 成严重的经济损失。 由于 ORFV体外生存能力强， 羊群一旦 发生感染很难进 行清除， 可持续多 年对羊群造成危害。 因此， 该病不仅对养羊业的危害较为突出， 从事饲养、 屠宰、 兽医等职 业 的从业人员也常发生感染， 对 全球公共卫 生安全也带来了严峻挑战。 [0003]目前尚无有效的特异性药物用于羊传染性脓疱病的治疗， 疫苗接种仍然是预防和 控制该病的重要措施， 尽管针对ORFV疫苗研究也取得了积极的进展， 但常规的灭活疫苗和 弱毒疫苗存在的缺陷， 使得疫苗的安全性和免疫保护效果尚待提高。 因此急需开展安全有 效的羊传染性脓疱病疫苗的创新， 这对于羊传染性脓疱病的防治至关重要。 [0004]天然免疫是宿主抵御病原微生物入侵的第一道防线， 在宿主抗病毒反应中发挥重 要作用。 ORFV是痘病毒科、 副痘病毒属的代表种， 基因组庞大， 编码蛋白种类众多， 研究发 现， ORFV在长期进化过程中可通过末端基因组编码的多种免疫调节蛋白来拮抗宿 主的天然 免疫以利于自身的存活。 此外， ORFV末端区的这些免疫调节基因也多为毒力相关基因， 这些 毒力基因的存在导致当前常规灭活疫苗的毒性作用大于预防效果， 存在一定的安全隐患。 当前， 毒力基因缺失减毒疫苗是新型疫苗研究 的一个热点， 而构建、 筛选及鉴定ORFV免疫调 节/毒力基因缺 失毒株将为后 期羊传染性脓疱病毒基因缺失减毒活疫苗的研发提供重要的 物质基础。 [0005]减毒活疫苗不仅具有有效诱导机体产生细胞免疫、 体液免疫及黏膜免疫等优点， 同时越来越多毒力基因的成功挖掘使得减毒疫苗的安全性能够获得保障， 因此， 安全有效 的ORFV基因缺失减毒疫苗是未来开展新型、 高效疫苗研发的一个重要方向， 有望在羊传染 性脓疱病防控中发挥重要作用。 本发 明选择ORFV基因组右末端的ORFs  120/121基因作为毒 力基因敲除靶标， 利用经典的同源重组技术成功构建ORFV ‑SY17ΔORFs  120/121‑eGFP双基 因缺失减毒株， 其不仅具有作为制备羊传染性脓疱病基因缺 失减毒活疫苗生产毒株的潜在 应用价值， 而且临床上可用于鉴别和诊断人工免疫羊和自然感染羊， 有利于建立ORFV疫苗 毒和野毒检测的鉴别诊断方法。 发明内容 [0006]本发明针对羊传染性脓疱病疫苗缺乏和已知疫苗的有效性不理想的现状， 提供了 一种荧光标记的羊传染性脓疱病毒(ORFV)ORFs  120/121双基因缺失毒株的构建方法， 所述 缺失ORFs120/121基因的毒株(ORFV ‑SY17ΔORFs  120/121‑eGFP)是利用同源重组技术， 从说　明　书 1/7 页 3 CN 114350623 A 3