(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210035336.6 (22)申请日 2022.01.13 (71)申请人 南京师范大学 地址 210023 江苏省南京市栖霞区文苑路1 号 (72)发明人 黄和　吴丽娜　吴香椽　王鑫杰　 黄行许　 (74)专利代理 机构 北京润平知识产权代理有限 公司 11283 专利代理师 王崇 (51)Int.Cl. C12Q 1/6825(2018.01) C12Q 1/70(2006.01) C12N 15/11(2006.01) G01N 21/78(2006.01)C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 比色生物传感器及其制备方法和检测新型 冠状病毒的方法 (57)摘要 本发明涉及分析检测领域， 公开了一种比色 生物传感器及其制备方法和检测新型冠状病毒 的方法。 该比色生物传感器包括表 面修饰有链霉 亲和素的磁珠、 修饰有生物素的单链DNA和氨基 化的二氧化锰纳米棒， 单链DNA通过生物素与磁 珠上的链霉亲和素连接， 单链DNA远离磁珠的一 端与氨基化的二氧化锰纳米棒连接。 本发明还提 供该比色生物传感器在检测新型冠状病毒中的 应用， 检测新型冠状病毒的方法包括以下步骤： 将待检测的病毒RNA进行扩增得到待测DNA， 将 待 测DNA与CRISPR ‑Cas12a体系溶液、 比色生物传感 器混合得到初始溶液， 将初始溶液进行反应III 后经磁选得到待测传感器， 将待测传感器与显色 剂混合进行显色反应后检测吸光度。 该生物传感 器的检测灵敏度高， 且有效缩短目标DNA的检测 时间， 实用性高。 权利要求书2页 说明书13页 序列表2页 附图4页 CN 114480583 A 2022.05.13 CN 114480583 A 1.一种比色生物传感器， 其特征在于， 包括表面修饰有链霉亲和素的磁珠、 修饰有生物 素的单链DNA和氨基化的二氧化锰纳米棒， 所述单链DNA 通过所述生物素与所述磁珠上的链 霉亲和素 连接， 所述单链DNA远离所述磁珠的一端与所述氨基化的二氧化锰纳米棒连接 。 2.根据权利要求1所述的比色生物传感器， 其特征在于， 所述单链DNA的核苷酸序列如 SEQ ID No.1所示。 3.根据权利要求1所述的比色生物传感器， 其特征在于， 相对于1mg的所述表面修饰有 链霉亲和素的磁珠， 所述修饰有生物素的单链DNA的用量为1 ×10‑4‑3×10‑4μmol， 所述氨基 化的二氧化锰纳米棒的用量 为1‑3 μmol。 4.一种比色生物传感器的制备 方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： (1‑1)在反应溶剂I中， 将修饰有生物素和羧基的单链DNA与表面修饰有链霉亲和素的 磁珠混合进行反应I， 使得所述单链DNA通过所述生物素与所述磁珠上的链霉亲和素连接， 然后经磁分离I得到磁珠 ‑DNA； (1‑2)在反应溶剂II中， 将所述磁珠 ‑DNA与1‑(3‑二甲氨基丙基) ‑3‑乙基碳二亚胺盐酸 盐和N‑羟基琥珀酰 亚胺混合进行孵 育， 然后经磁分离I I得到羧基活化的磁珠 ‑DNA； (1‑3)在反应溶剂III 中， 将所述羧基活化的磁珠 ‑DNA与氨基化的二氧化锰纳米棒混合 进行反应II， 使得所述单链DNA远离所述磁珠的一端与所述氨基化的二氧化锰纳米棒连接， 然后经磁分离I II得到所述比色生物传感器。 5.根据权利要求4所示的制备方法， 其特征在于， 所述反应溶剂I、 所述反应溶剂II和反 应溶剂III分别独立 地为水和/或Tris ‑HCl缓冲液； 优选地， 相对于1mg的所述表面修饰有链霉亲和素的磁珠， 所述修饰有生物素的单链 DNA的用量 为1×10‑4‑3×10‑4μmol， 所述氨基化的二氧化锰纳米棒的用量 为1‑3 μmol； 优选地， 相对于1mg的所述表面修饰有链霉亲和素的磁珠， 所述反应溶剂I的用量为 150‑250 μL， 所述反应溶剂II的用量为2 50‑350 μL， 所述反应溶剂III的用量为150 ‑250 μL， 所 述1‑(3‑二甲氨基丙基) ‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐的用量为3 ‑5 μmol， 所述N ‑羟基琥珀酰亚胺 的用量为0.5‑1.5 μmol； 优选地， 所述单链DNA的核苷酸序列如SEQ  ID No.1所示。 6.根据权利要求4或5所示的制备方法， 其特征在于， 步骤(1 ‑1)中所述反应I的条件包 括： 温度为3 0‑45℃， 时间为0.5 ‑1.5h； 优选地， 步骤(1 ‑1)还包括： 将所述磁分离I得到的物质进行清洗得到所述磁珠 ‑DNA； 优选地， 步骤(1 ‑2)中所述孵 育的条件 包括： 温度为3 0‑45℃， 时间为0.5 ‑1.5h； 优选地， 步骤(1 ‑3)中所述反应I I的条件包括： 温度为2 ‑8℃， 时间为8 ‑16h； 优选地， 步骤(1 ‑3)还包括： 将所述磁分离III得到的物质进行清洗得到所述比色生物 传感器。 7.权利要求1至3中任意一项所述的比色生物传感器或者根据权利要求4至6中任意一 项所述的制备 方法制得的比色生物传感器在检测新型 冠状病毒中的应用。 8.一种检测新型 冠状病毒的方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： (2‑1)将待检测的病毒RNA进行扩增得到待测DNA， 将所述待测DNA与CRISPR ‑Cas12a体 系溶液、 比色生物传感器混合得到初始溶 液， 将所述初始溶 液进行反应I II得到反应液； (2‑2)将所述反应液经磁选得到待测传感器， 以所述初始溶液中等量的比色生物传感权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114480583 A 2器作为对照传感器， 将所述待测传感器和所述对照传感器分别与显 色剂混合进行显 色反应 后， 检测吸光度得到样品吸光值和对照吸光值， 将所述样品吸光值与所述对照吸光值进行 比较； 所述比色生物传感器为权利要求1至3 中任意一项所述的比色生物传感器， 或者根据权 利要求4至6中任意一项所述的制备 方法制得的比色生物传感器。 9.根据权利要求8所述的方法， 其特征在于， 步骤(2 ‑1)中， 所述扩增的的过程包括： 将 含有所述待检测的病毒RNA的溶液、 缓冲液I、 含有引物R的溶液、 含有引物F的溶液和含有 Mg2+的溶液混合， 进行扩增反应； 其中， 所述引物R的核苷酸序列如 SEQ ID No.2所示， 所述引 物F的核苷酸序列如SEQ  ID No.3所示； 优选地， 所述扩增反应的条件 包括： 温度为3 0‑45℃， 时间为3 0‑50min； 优选地， 所述CRISPR ‑Cas12a体系溶液含有crRNA、 Cas12a蛋白、 核糖核酸酶抑制剂和缓 冲剂II； 其中， 所述crRNA的核苷酸序列如SEQ  ID No.4所示， 所述待测DNA中能够激活所述 Cas12a蛋白的目标DNA片段序列如SEQ  ID No.5所示； 优选地， 所述反应I II的条件包括： 温度为3 0‑45℃、 时间为0.5 ‑1.5h。 10.根据权利要求8或9所述的方法， 其特征在于， 步骤(2 ‑2)中， 所述磁选的时间为30 ‑ 90s， 所述显色剂为3,3' ,5,5'‑四甲基联 苯胺； 优选地， 所述吸光度的测量波长为640 ‑660nm。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114480583 A 3