(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210058563.0 (22)申请日 2022.01.13 (71)申请人 潍坊医学院 地址 261053 山东省潍坊市潍城区宝通西 街7166号 (72)发明人 李恒　张晓宇　张郁勃　乔晋娟　 孟祥英　 (74)专利代理 机构 北京汇捷知识产权代理事务 所(普通合伙) 11531 专利代理师 张燕燕 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12N 15/113(2010.01)C12R 1/32(2006.01) (54)发明名称 一种检测结核分枝 杆菌的组合物、 试剂盒及 其应用 (57)摘要 本发明涉及基因检测技术领域， 特别涉及一 种检测结核分枝杆菌的组合物、 试剂盒及其应 用。 包括针对结核分枝杆菌保守序列的RAA引物 和结核分枝杆菌 特异性crRNA； 所述crRNA序列包 括如SEQ ID NO:2或SEQ  ID NO:4中的任一种 所 示。 本发明利用crRNA 的特异性有效保证对细菌 特征序列核酸检测的正确度， 且37℃下1小时内 即可通过荧光或试纸确定样品中是否存在MTB。 本发明可方便快速地对MTB进行检测， 且不需要 复PCR仪器等复杂设备， 只需要一个恒温装置及 简易荧光检测装置即可快速获得可观测的结果， 为MTB的检测提供更低成本， 更加快速方便的检 测方法， 对于MTB感染的早期监测与防控有重要 的意义。 权利要求书1页 说明书7页 序列表2页 附图3页 CN 114480682 A 2022.05.13 CN 114480682 A 1.一种检测结核分枝杆菌的组合物， 其特征在于： 包括针对结核分枝杆菌保守序列的 RAA引物和结核分枝杆菌特异性crRNA； 所述crRNA序列包括如SEQ  ID NO:2或SEQ  ID NO:4中的任一种所示。 2.根据权利要求1所述的检测结核分枝杆菌的组合物， 其特征是： 所述引物包括如SEQ   ID NO:5和SEQ  ID NO:6所示的序列， 或所述引物包 括如SEQ ID NO:7和SEQ  ID NO:8所示的 序列。 3.一种检测结核分枝杆菌的试剂盒， 其特征在于： 包括权利要求1 ‑2任一项所述的检测 结核分枝杆菌的组合物。 4.根据权利要求3所述的检测结核分枝杆菌的试剂盒， 其特征是： 还包括Cas12a蛋白、 报告单链DNA分子 探针。 5.根据权利 要求4所述的检测结核分枝杆菌的试剂盒， 其特征在于： 所述Cas12a蛋白为 LbCas12a； 所述报告单链DNA分子 探针序列为： 5 ′ ‑FAM‑TTTTTT‑BHQ1‑3′。 6.根据权利要求3所述的检测结核分枝杆菌的试剂盒， 其特征在于： 还包括RAA扩增体 系和CRIS PR/Cas12a检测体系试剂。 7.根据权利要求1 ‑2任一项所述的检测结核分枝杆菌的组合物在开发和/或制备具有 结核诊断和/或预后评估用途的产品中的应用。 8.一种检测结核分枝杆菌的试纸条， 其特征在于： 包括权利要求1 ‑2任一项所述的检测 结核分枝杆菌的组合物和/或利用权利要求3 ‑6任一项所述的试剂盒中的组分构建得到 。 9.一种非诊断治疗目的 的检测结核分枝杆菌的方法， 其特 征在于， 包括如下步骤： (1)取待测样品， 提取MTB基因 组； (2)RAA等温扩增： 以权利要求1 ‑2任一项中的引物， 通过RAA方法扩增步骤(1)中得到的 基因组； (3)CRISPR/Cas12a检测： 取步骤(2)中的扩增产物， 加入报告单链DNA分子探针、 Cas12a 蛋白和权利要求1 ‑2任一项中的crRNA， 进行CRIS PR/Cas12a检测， 并读取检测信号。 10.根据权利要求9所述的方法， 其特征在于， 所述方法能够区分出106CFU/mL、 107CFU/ mL MTB荧光值梯度的RA A扩增时间。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114480682 A 2一种检测结核分枝杆菌的组合物、 试剂盒及其应用 技术领域 [0001]本发明涉及基因检测技术领域， 特别涉及一种检测结核分枝杆菌的组合物、 试剂 盒及其应用。 背景技术 [0002]结核分枝杆菌(Mycobacterium  tuberculosis， MTB)是一种可以通过气溶胶传播 引起人畜共患病的细菌， 据 《2021年全球结核病报告》 显示， 全球约有20亿人感染结核分枝 杆菌， 990万人患有 结核病， 其中印度、 中 国和俄罗斯负 担最重， 中 国作为全球耐多 药结核病 负担第二大的地区， 开发新型抗结核 药物和研究结核分枝杆菌耐药机制成为中 国防治结核 病的重点工作。 [0003]由于结核分枝杆菌生长缓慢， 目前传统的结核病检测及耐药检测方法耗时长达数 月， 而相对快速的方法需要复杂仪器或进口试剂， 以上因素极大 的阻碍了我国对结核病的 有效防控。 CRISPR全称Clustered  Regularl y Interspac ed Short Palindromic  Repeats， 成簇的规律间隔的短回文重复序列， 是一个广泛存在于细菌和古生菌基因组中的特殊DNA 重复序列 家族。 近些年来， CRISPR/Cas系统被开发成了进行基因编辑的强大工具， 可以对基 因进行定点的精确编辑。 我们利用CRISPR/Cas系统建立了结核分枝杆菌特异性检测方法， 同时联合重组酶介导等温核 酸扩增技术(Recombinase  Aided Amplification， RAA)提高检 测系统的灵敏度， 实现检测信号的 “两级”放大化。 [0004]2020年全球结核病患者登记数较2019年下降了18％， 由710万例降至580万例 。 此 外， 新冠肺炎大流行也导致接受治疗的耐多 药/利福平耐药结核病患者数下降了15％， 接受 预防性治疗的患者下降了22％， 用于结核病预防诊断和治疗服务的费用下降了9％， 由于基 本结核病服务中断， 估计造成了2020年全球结核病死亡的患者数约增加 了10万例， 所以快 速、 精确、 价格适宜的结核分枝杆菌检测技 术亟待开发。 发明内容 [0005]针对现有技术存在的不足， 本发明要解决的技术问题是克服现有MTB早期监测防 控技术的缺陷和不足， 提供一种高灵敏度、 高特异性、 操作方法简单、 快速、 精准检测 MTB的 组合及试剂盒， 无需昂贵仪器设备和专业标准实验室， 实现MTB的监测与防控。 [0006]本发明为实现上述目的采用的技术方案是： 一种检测结核分枝杆菌 的组合物， 包 括针对结核分枝杆菌保守序列的RA A引物和结核分枝杆菌特异性crRNA； [0007]所述crRNA序列包括如SEQ  ID NO:2或SEQ  ID NO:4中的任一种所示。 [0008]进一步的， 所述引物包括如SEQ  ID NO:5和SEQ  ID NO:6所示的序列， 或所述引物 包括如SEQ  ID NO:7和SEQ  ID NO:8所示的序列。 [0009]本发明还包括一种检测结核分枝杆菌的试剂盒， 包括上述的检测结核分枝杆菌的 组合物。 [0010]进一步的， 还包括Cas12a 蛋白、 报告单链DNA分子 探针。说　明　书 1/7 页 3 CN 114480682 A 3