(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210041876.5 (22)申请日 2022.01.14 (71)申请人 江苏科技大学 地址 212008 江苏省镇江市梦溪路2号 (72)发明人 李刚　钱荷英　徐安英　赵国栋　 郭会朵　 (74)专利代理 机构 南京正联知识产权代理有限 公司 32243 代理人 卢霞 (51)Int.Cl. C12N 15/10(2006.01) C12Q 1/6806(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12Q 1/6888(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种从蚕蜕或蛹蜕样品中快速提取基因组 DNA的试剂盒及方法 (57)摘要 本发明涉及分子生物学领域， 公开了一种从 蚕蜕或蛹蜕样品中快速提取基因组DNA的试剂盒 及方法。 采用配制的试剂盒， 可 以从蚕蜕或蛹蜕 中抽提出较高质量的基因组DNA， 经过琼脂糖凝 胶电泳和分光光度计检测证明该方法得到的DNA 满足后续实验的质量要求。 本方法可对整合有外 源基因的个体进行整个生命周期及后代的跟踪 观察。 利用本方法提取的蚕蜕基因组DNA具有重 复性好、 省时省力、 获得率高、 质量好等优点， 且 不采用有毒试剂。 因此， 在实际工作中可根据实 验目的、 条件选取本试剂盒及方法。 权利要求书2页 说明书7页 序列表1页 附图3页 CN 114196670 A 2022.03.18 CN 114196670 A 1.一种从蚕蜕或蛹蜕样品中快速提取基因组DNA的试剂盒， 其特征在于， 主要由下述3 种缓冲液组成： 1)BufferA， 组分为： 100mmol/L  Tris‑HCL， pH 7.5； 100mmol/L  EDTA； 100mmol/L  NaCl； 0.5％SDS； 所述Buf ferA的pH值为7.5， 溶剂为蒸馏水； 2)BufferB， 5mo l/L KAC与6mo l/L LiCl进行1:2.5的体积比进行配置而成； 3)BufferC， 为无 水乙醇， 使用前加入25ml  ddH2O混匀， 预冷使用。 2.采用如权利要求1所述的试剂盒从蚕蜕或蛹蜕中快速提取基因组DNA的方法， 其特征 在于， 包括如下步骤： 1)取蚕蜕或蛹蜕放于研钵中， 液氮充分研磨， 然后加入Buf ferA研磨至细粉末状； 2)将粉末小心转移至 离心管中， 6 5℃水浴2小时， 期间取 出上下混匀2次； 3)加BufferB上下轻轻混匀， 置冰上10mi n； 4)4℃120 00rpm离心15mi n； 5)小心吸取 上清液于新的离心管中， 操作过程中避免吸取底部沉淀； 6)加入预冷异丙醇， 轻 轻混匀， 放置15mi n， 可见白色絮状沉淀产生； 7)弃上清， 加入Buf ferC清洗2次， 自然干燥； 8)加入TE buffer或ddH2O， 充分溶解DNA， ‑20℃保存备用。 3.使用SSR标记技术对如权利要求2所述方法抽提得到的基因组DNA进行扩增的方法， 其特征在于， 包括如下步骤： (1)SSR引物选择： 选取S SR引物S1215 Forward‑GCACTTTATCTCCTCAGCTAC CG Reverse‑TTGGAATAGAGTG GCACGGTTT (2)PCR扩增 所用PCR仪为Flexigene,Tec hne 当PCR反应 体系为20 μl， 所用PCR反应试剂及用量分别如下： 为了增加PCR的特异性， 实验 采用Touc h Down PCR(TD‑PCR)程序： 94℃变性： 5mi n 第1个循环： 94℃3 0sec， 63℃1min， 72℃1mi n； 第2个循环： 94℃3 0sec， 62.5℃1mi n， 72℃1mi n；权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114196670 A 2第3个循环： 94℃3 0sec， 62℃1mi n， 72℃1mi n； …… 第15个循环： 94℃3 0sec， 56℃1min， 72℃1mi n； 前15个循环退火温度每次降低0.5℃， 由63℃降至56℃； 后25个循环退火温度采用 56 ℃， 即 第16‑25个循环： 94℃3 0sec， 56℃1min， 72℃1mi n； 72℃延伸： 5mi n； 4℃保温； PCR反应结束后， 取3 μl产物在1.5％ 的琼脂糖凝胶中电泳分离， 并以标准浓度的DL2000   DNA作为标准， 检测PCR产物的扩增效果及浓度。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114196670 A 3