(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210044043.4 (22)申请日 2022.01.14 (71)申请人 华南农业大 学 地址 510000 广东省广州市天河区五山 申请人 贵州省烟草科学研究院 (72)发明人 尹国英　 (74)专利代理 机构 贵阳中新专利商标事务所 52100 代理人 张行超 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12N 15/11(2006.01) G16B 20/30(2019.01) G16B 25/10(2019.01) (54)发明名称 一种水稻茉莉酸相关miRNAs的高通量精准 筛选方法 (57)摘要 本发明公开了一种水稻茉莉酸相关miRNAs 的高通量精准筛选方法， 包括以下步骤： 1)从水 稻基因组水平筛选启动子中含茉莉酸调控元件 的miRNAs； 2)根据高通量测序数据筛选 茉莉酸甲 酯处理后表达量改变的miRNAs； 3)比较筛选 出含 茉莉酸调控元件且响应茉莉酸甲酯处理的 miRNAs； 4)对 步骤3)中筛选出的miRNAs进行定量 PCR， 筛选出茉莉酸甲酯处理后表达量发生改变 的miRNAs。 本发明结合基因组序列和基因表达两 种策略实现了高通量精准鉴定水稻茉莉酸相关 miRNAs的目的， 对植物激素相关miRNA的研究具 有重要意 义。 权利要求书1页 说明书8页 序列表10页 附图4页 CN 114350842 A 2022.04.15 CN 114350842 A 1.一种水稻茉莉酸相关 miRNAs的高通 量精准筛 选方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： 1)从水稻基因 组水平筛 选启动子中含茉莉酸调控元件的miRNAs； 2)根据高通 量测序数据筛 选茉莉酸甲酯处 理后表达量改变的miRNAs； 3)比较筛选出含茉莉酸调控元件 且响应茉莉酸甲酯处 理的miRNAs； 4)对步骤3)中筛选出的miRNAs进行定量PCR， 筛选出茉莉酸甲酯处理后表达量发生改 变的miRNAs， 作为水稻茉莉酸相关 miRNAs。 2.根据权利 要求1所述的水稻茉莉酸相关miRNAs的高通量精准筛选方法， 其特征在于， 所述步骤1)的具体方法为： 以水稻亚洲栽培稻Oryza  sativa粳稻品种日本晴Nipponbare为材料， 从水稻 基因组注 释计划数据库中下载Release  7.0数据集； 从miRBase数据库下载Release  21.0中水稻 Oryza sativa)的所有前体和成熟序列； 重新注释miRNA， 使用fastxtool去除适配序列， 将 重复的reads合并为单个条目， 并去除19 ‑24nt范围外的reads， 用miRDeep ‑P对每个的 MIRNAs进行de  nove鉴定， 找出miRNA； 从基因组中提取基因序列， 以miRNA的前体序列与 这些基因序列进行比对， 找出来自于 基因的miRNA， 筛选来自于基因间区的miRNA， 对于基因间的miRNA， 提取miRNA前体起始位点 上游2000bp的序列， 如果miRNA前体上游的基因间序列小于2000bp， 则只取基因间序列； 通 过TSSP程序预测miRNA前体序列上游的转录起始位点及TATA ‑box， 运用PlantPAN2.0数据库 和PlantCARE数据库对miRNA启动子进行结构分析， 预测可能存在的顺式作用元件， 寻找茉 莉酸调控元件TGACG ‑motif和CGTCA ‑motif的miRNAs， 将含有茉莉酸调 控元件数量大于4个 以上的miRNAs作为茉莉酸相关 miRNAs。 3.根据权利 要求1所述的水稻茉莉酸相关miRNAs的高通量精准筛选方法， 其特征在于， 所述步骤2)的具体方法为： 从RiceXPro数据库下载水稻日本晴茎和根两个组织在 茉莉酸甲酯处理不同时长的RNA 测序数据， 找出表达量改变的miRNAs， 即响应茉莉酸甲酯处 理的miRNAs。 4.根据权利 要求1所述的水稻茉莉酸相关miRNAs的高通量精准筛选方法， 其特征在于， 所述步骤3)的具体方法为： 比较步骤1)中含 茉莉酸调控 元件的miRNAs和步骤2)中经茉莉酸 甲酯处理后表达量改变的miRNAs， 找出含茉莉酸调控元件且响应茉莉酸甲酯处理的 miRNAs。 5.根据权利 要求1所述的水稻茉莉酸相关miRNAs的高通量精准筛选方法， 其特征在于， 所述步骤5)的具体方法为： 以步骤3)筛选出的茉莉酸相关miRNAs为对象， 以萌发30d的水稻根和幼苗为材料， 分别 用茉莉酸处理2个组织， 对照用ddH2O以同样的方式进行处理， 处理24h后取植物组织， 用 Trizol法提取所需组织Total  RNA， 用DNase  I去除残余的DNA， 用MiRNARTprimer设计含有 待测miRNA 3′端的6个互补碱基并且能形成颈环结构的特异引物， 利用试剂盒进行反转录， 将反转录所得的cDNA稀释后， 用SYBR  Green PCR反应体系于荧光定量PCR仪中进行扩增， 根 据定量PCR的结果筛 选出表达量与对照存在明显异常的miRNAs。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114350842 A 2一种水稻 茉莉酸相关miRNA s的高通量精准筛选方 法 技术领域 [0001]本发明涉及一种水稻茉莉酸相关miRNAs的高通量精准筛选方法， 属于茉莉酸相关 的miRNA的筛 选技术领域。 背景技术 [0002]microRNA(miRNA)是近年来发现的真核生物体内普遍存在的一类具有重要调控功 能的非编码小分子RNA(sRNA)， 其大小在20 ‑25nt之间。 大量研究发现miRNA与物种进化过程 中重要性状的形成息息相关， 在植物的生长、 发育和逆境胁迫应答等各种生物学过程中发 挥重要的调节作用。 [0003]茉莉酸及其衍生物是一种广泛分布于植物幼嫩组织和生殖发育器官中的植物激 素。 茉莉酸信号途径调控着植物的生长发育过程和逆境应答反应。 近年来， 已有 数个参与茉 莉素信号途径的miRNA在植物中先后被鉴定。 研究表明， 拟南芥miR319与主效靶基因TCP4可 以控制JA的生物 合成， 从而调控 茉莉酸通路及叶片的生长发育和衰老。 近期研究发现， AGO1 蛋白除了具有与miRNA结合， 通过切割靶mRNA从而在转录后水平抑制靶基因表达的功能外， 还可以参与植物对茉莉酸和逆境胁迫的响应， 直接影响茉莉酸通路基因的激活和信号转 导。 2020年Y ang等研究发现茉莉酸信号转录激活Argonaute  18(AGO18)， 这是一个核心RNA 沉默元件， 通过隔离miR168和miR528来促进水稻抗病毒防御。 以上研究结果表明， miRNA与 茉莉酸参与的植物胁迫应答反应密切相关。 [0004]以往茉莉酸相关miRNA的鉴定大多采用激素处理和小RNA测序的方法来筛选差异 表达的miRNA， 然而这种茉莉酸相关miRNA的筛选方法难以全面准确鉴定茉莉酸相关的 miRNA。 发明内容 [0005]基于上述， 本发明提供一种水稻茉莉酸相关miRNAs的高通量精准筛选方法， 以解 决现有筛 选方法难以快速、 全面、 准确鉴定茉莉酸相关的miRNA的技 术问题。 [0006]本发明的技术方案是： 一种水稻茉莉酸相关miRNAs的高通量精准筛选方法， 包括 以下步骤： [0007]1)从水稻基因 组水平筛 选启动子中含茉莉酸调控元件的miRNAs； [0008]2)根据高通 量测序数据筛 选茉莉酸甲酯处 理后表达量改变的miRNAs； [0009]3)比较筛选出含茉莉酸调控元件 且响应茉莉酸甲酯处 理的miRNAs； [0010]4)对步骤3)中筛选出 的miRNAs进行定量PCR， 筛选出茉莉酸处理后表达量发生改 变的miRNAs， 作为水稻茉莉酸相关 miRNAs。 [0011]可选的， 所述 步骤1)的具体方法为： [0012]以水稻亚洲栽培稻Oryza  sativa粳稻品种日本晴Nipponbare为材料， 从水稻基因 组注释计划数据库中下载 Release 7.0数据集； 从miRBase数据库下载 Release 21.0中水稻 Oryza sativa)的所有前体和成熟序列； 重新注释miRNA， 使用fastxtool去除适配序列， 将说　明　书 1/8 页 3 CN 114350842 A 3