(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210043837.9 (22)申请日 2022.01.14 (71)申请人 西南石油大 学 地址 610500 四川省成 都市新都区新都大 道8号 (72)发明人 兰贵红　刘萌　徐波　陈祉伊　 邱海燕　王顺慧　 (74)专利代理 机构 北京慕达星云知识产权代理 事务所 (特殊普通合伙) 11465 代理人 崔自京 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种硫酸盐还原菌的检测引物及快速检测 方法 (57)摘要 本发明公开了一种硫酸盐还原菌的检测引 物及快速检测方法， 属于硫酸盐还原菌的检测技 术领域。 本发 明公开的一种硫酸盐还原菌的快速 检测方法， 包括提取样品DNA； 以提取的DNA为模 板， 利用引物DsrB ‑F和DsrB‑R进行qPCR扩增； 根 据标准曲线Y＝ ‑3.16X+34.45计算硫酸 盐还原菌 的数量。 本发 明能够快速准确定量检测水样中是 否含有硫酸盐还原菌及硫酸盐还原菌的数量。 权利要求书1页 说明书4页 序列表1页 附图3页 CN 114317793 A 2022.04.12 CN 114317793 A 1.一种硫酸盐还原菌的检测引物， 其特 征在于， 所述引物序列如下： DsrB‑F： 5’ ‑GCCTGCTGYCTGAACATGTG‑3’； SEQ ID NO.1； DsrB‑R： 5’ ‑GTAGCAGT TACCGCAGWACATGC ‑3’； SEQ ID NO.2； 其中， Y代 表C/T； W代表A/T。 2.一种硫酸盐还原菌的快速检测方法， 其特 征在于， 具体步骤如下： (1)提取样品DNA； (2)以步骤(1)提取的DNA为模板， 利用权利要求1所述的引物进行qPCR扩增； 所述qPCR扩增的反应体系共20 μL， 具体如下： DNA  2 μL， Master  qPCR Mix 10 μL， 0.4μM   DsrB‑F 0.8 μL， 0.4 μM  DsrB‑R 0.8 μL， ddH206.4 μL； 所述qPCR扩增的反应程序如下： 95℃预变性2min； 95℃变性30s， 55℃退火30s， 72℃延 伸30s， 40个循环后最终在6 0℃终延伸5mi n； (3)根据标准曲线Y＝ ‑3.16X+34.45计算硫酸盐还原菌的数量。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114317793 A 2一种硫酸盐还原菌的检测引物及快速检测方 法 技术领域 [0001]本发明涉及硫酸盐还原菌的检测技术领域， 更具体的说是涉及 一种硫酸盐还原菌 的检测引物及快速检测方法。 背景技术 [0002]硫酸盐还原菌(SRB)是一类能把亚硫酸盐、 硫代硫酸盐、 硫酸盐和单硫还原为硫化 物的微生物， 这类微生物可分为自养型和异养型， 异养型硫酸盐还原菌通常是严格厌氧菌。 硫酸盐还原菌在自然界中分布范围广泛， 常见于土壤、 海水、 地下管道和输油管道等环境 中。 [0003]硫酸盐还原菌是造成微生物腐蚀(MIC)的典型代表， 广泛存在于油气田地层水、 采 出水、 海洋水、 土壤、 地下采油管道内壁和油气开采井等厌氧环境中。 在油田注水系统的管 道设备中， SRB能在 厌氧条件下大量繁殖， 产生大量黏液状胞外聚合物(EPS)， 在管道内壁形 成一层厚的生物膜垢， 造成注水管道的堵塞， 并在管道设施中造成严重的局部腐蚀。 在发生 微生物腐蚀时， 其主要的矿化产物是CaCO3与FeS。 SRB除了 自身的腐蚀破坏性， 常常诱发管 道的应力腐蚀开裂(SCC)、 缝隙腐蚀、 疲劳裂纹尖端脆化和沉积下腐蚀， 极易引发油气井堵 塞和油气管道泄漏事故。 [0004]目前最常用的检测SRB的方法是最大可能数法(MP N法)， 该培养法是指将乳酸钠为 碳源， 酵母粉为营养源， 硫酸根离子作为电子受体的选择性培养基， 将梯度稀释后的SRB水 样接种加入到其中， 用硫酸亚铁作为指示剂确定SRB的存在， 但此方法耗时过长， 一般需要 两周的时间。 对于在页岩气开采过程中出现的腐蚀情况将会处理相对不及时。 因此需要寻 求一种可以实时分析SRB含量的检测方法， 以及时采取防腐措施， 防止管道腐蚀， 保障工业 的正常运行。 [0005]随着qPCR技术的兴起， 很多微生物的定量分析都依靠此种技术， 且qPCR技术耗时 既短准确度也较高。 [0006]因此， 提供一种针对页岩气采出水 中硫酸盐还原菌的检测引物及快速检测方法是 本领域技术人员亟需解决的问题。 发明内容 [0007]有鉴于此， 本发明提供了一种硫酸盐还原菌 的检测引 物及快速检测方法， 利用该 引物定量检测页岩气开采过程中的采出 水中硫酸盐还原菌的数量。 [0008]为了实现上述目的， 本发明采用如下技 术方案： [0009]一种硫酸盐还原菌的检测引物， 所述引物序列如下： [0010]DsrB‑F： 5’ ‑GCCTGCTGYCTGAACATGTG‑3’； SEQ ID NO.1； [0011]DsrB‑R： 5’ ‑GTAGCAGT TACCGCAGWACATGC ‑3’； SEQ ID NO.2； [0012]其中， Y代 表C/T； W代表A/T。 [0013]进一步， 一种硫酸盐还原菌的快速检测方法， 具体步骤如下：说　明　书 1/4 页 3 CN 114317793 A 3