(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210044295.7 (22)申请日 2022.01.14 (71)申请人 杭州瑞普基因科技有限公司 地址 311100 浙江省杭州市余杭区五常街 道联创街18 8号贝达梦工场D座7-10层 (72)发明人 濮悦　王涛　任文静　周焕焕　 (74)专利代理 机构 北京清亦华知识产权代理事 务所(普通 合伙) 11201 专利代理师 吴婷 (51)Int.Cl. C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种用于检测FGF19基因过表达的核酸组合 物、 试剂盒及其应用 (57)摘要 本发明涉及一种用于检测FGF19 基因过表达 的核酸组合物、 试剂盒及其应用。 具体地， 所述核 酸组合物包括FGF 19基因的上游引物、 FGF 19基因 的下游引物和FGF19基因的探针， 其中， 所述 FGF19基因的上游引物选自以下至少之一： 具有 如SEQ ID NO:1所示 的核酸序列、 具有如SEQ  ID  NO:7所示的核酸序列、 具有如SEQ  ID NO:8所示 的核酸序列和/或具有如SEQ  ID NO:9所示的核 酸序列， 所述FGF19基因的下游引物具有如SEQ   ID NO:2所示的核酸序列、 具有如SEQ  ID NO:10 所示的核 酸序列、 具有如SEQ  ID NO:11所示的核 酸序列和/或具有如SEQ  ID NO:12所示的核酸序 列， 所述FGF19基因的探针 具有如SEQ  ID NO:3所 示的核酸序列。 采用该核酸组合物能够直接定量 检测FGF19基因的过表达倍数， 实现只需普通的 荧光定量PCR仪就能完成基因过表达的快速检 测。 权利要求书3页 说明书8页 序列表3页 附图2页 CN 114507718 A 2022.05.17 CN 114507718 A 1.一种用于检测FGF19基因过表达的核酸组合物， 其中， 所述核酸组合物包括FGF19基 因的上游引物、 FGF19基因的下游引物和FGF19基因的探针， 其中， 所述FGF19基因的上游引物选自以下至少之一： 具有如SEQ  ID NO:1所示的核酸序列、 具有如SEQ  ID NO:7所示的核酸序列、 具有如SEQ  ID NO:8所示的核酸序列和/或具有如SEQ   ID NO:9所示的核酸序列， 所述FGF19基因的下游引物具有如SEQ  ID NO:2所示的核酸序列、 具有如SEQ  ID NO:10 所示的核酸序列、 具有如SEQ  ID NO:11所示的核酸序列和/或具有如SEQ  ID NO:12所示的 核酸序列， 所述FGF19基因的探针具有如SEQ  ID NO:3所示的核酸序列。 2.根据权利要求1所述的核酸组合物， 其中， 所述核酸组合物进一步包括内参基因 GAPDH的上游引物、 内参基因GAPDH的下游引物和内参基因GAPDH的探针， 所述内参基因 GAPDH的上游引物具有如SEQ  ID NO:4所示的核酸序列， 所述内参基因GAPDH的下游引物具 有如SEQ ID NO:5所示的核酸序列， 所述内参基因GAPDH的探针具有如SEQ  ID NO:6所示的 核酸序列。 3.根据权利 要求1或2所述的核酸组合物， 其中， 所述FGF19基因的探针5 ’端标记荧光报 告基团， 3 ’端标记淬灭基团； 优选地， 所述FGF19基因的探针5 ’端标记FAM荧光报告基团， 3 ’ 端标记MGB淬灭基团， 任选地， 所述内参基因GAPDH的探针5 ’端标记荧光报告基团， 3 ’端标记淬灭基团； 优选 地， 所述内参基因GAP DH的探针5 ’端标记VIC荧光报告基团， 3 ’端标记MGB淬灭基团。 4.根据权利要求1 ‑3任一项所述的核酸组合物， 其中， 所述核酸组合物包括具有如SEQ   ID NO:1所示的核酸序列的所述FGF19基因的上游引物、 具有如SEQ  ID NO:2所示的核酸序 列的所述FGF19基因的下游引物、 具有如SEQ  ID NO:3所示的核酸序列的所述FGF19基因的 探针， 具有如SEQ  ID NO:4所示的核酸序列的所述内参基因GAPDH的上游引物、 具有如SEQ   ID NO:5所示的核酸序列的所述内参基因GAPDH的下游引物和具有如SEQ  ID NO:6所示的核 酸序列的所述内参基因GAP DH的探针， 任选地， 所述核酸组合物包括具有如SEQ  ID NO:1所示的核酸序列的所述FGF19基因的 上游引物、 具有如SEQ  ID NO:2所示的核酸序列的所述FGF19基因的下游引物和具有如SEQ   ID NO:3所示的核酸序列的所述FGF19基因的探针。 5.根据权利 要求1‑4任一项所述的核酸组合物， 其中， 所述FGF19基因的上游引物、 所述 FGF19基因的下游引物和所述FGF19基因的探针的摩尔比为10： 4： 5； 任选地， 所述内参基因GAPDH的上游引 物、 所述内参基因GAPDH的下游引物和所述内参 基因GAPDH的探针的摩尔比为6： 10： 5 。 6.一种试剂盒， 其中， 所述试剂盒包括权利要求1～5任一项所述的核酸组合物。 7.根据权利要求6所述的试剂盒， 其中， 所述试剂盒还包括逆转录反应液(包含逆转录 酶)、 PCR反应液、 酶混合液、 ROX参比染料和无核酶水， 任选地， 所述PCR反应液包括dNTPmix、 MgCl2和缓冲液， 任选地， 所述酶混合液包括Taq酶、 酶保护剂。 8.权利要求1～5任一项所述的核酸组合物在制备试剂中的用途， 所述试剂用于检测 FGF19基因过表达 。权　利　要　求　书 1/3 页 2 CN 114507718 A 29.一种检测FGF19基因过表达的方法， 包括如下步骤： (1)提取待测样本和对照样本的RNA； (2)采用权利要求1～5中任一项所述的核酸组合物或者权利 要求6或7中所述的试剂盒 配制逆转录反应 体系； (3)将步骤(2)中配制获得的逆转录反应 体系进行逆转录反应； (4)将步骤(3)中获得的cDNA产物与权利要求1～5中任一项所述的核酸组合物或者权 利要求6或7中所述的试剂盒配制PCR反应 体系； (5)将步骤(4)中配制获得的PCR反应 体系进行PCR反应； (6)将待测样本Ct值与对照样本Ct值按照2‑ΔΔCt方式计算， 得到待测样本中FGF19基因 表达倍数。 10.根据权利要求9所述的方法， 其中， 步骤(2)中所述的逆转录反应 体系为： 成份 加入量 LunaScript  RT SuperMix(5X) 4ul RNA 1ug Gene specific  primer mix(10 μM)* 2ul 灭菌双蒸水 To 20 μL 总体积 20 μL Gene specific  primer mix为FGF19、 GAP DH引物对混和， 配制方式如下： 任选地， 步骤(3)中所述的逆转录反应的反应条件为： 25℃2mi n、 55℃10min、 95℃1mi n。 11.根据权利要求9所述的方法， 其中， 步骤(4)中所述的PCR反应 体系为： 成份 加入量 2x PCR反应预混液 10 μL SEQ ID NO:1(10 μM) 2 μL SEQ ID NO:2(10 μM) 0.8 μL SEQ ID NO:3(10 μM) 1 μL SEQ ID NO:4(10 μM) 1.2 μL SEQ ID NO:5(10 μM) 2 μL SEQ ID NO:6(10 μM) 1 μL 模板cDNA 10ng 灭菌双蒸水 To 20 μL 总体积 20 μL权　利　要　求　书 2/3 页 3 CN 114507718 A 3