(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利 (10)授权公告 号 (45)授权公告日 (21)申请 号 202210046149.8 (22)申请日 2022.01.17 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 114075564 A (43)申请公布日 2022.02.22 (73)专利权人 广东华美众源生物科技有限公司 地址 528000 广东省佛山市禅城区季华 二 路北侧佛山国家火炬创新创业园C栋2 楼 专利权人 中山大学附属第三医院 (72)发明人 杜蔚安　黄怀球　郑阳阳　吳榕　 陆春　黄茜　黄志杰　邓诗莹　 (74)专利代理 机构 广州嘉权专利商标事务所有 限公司 4 4205 代理人 朱继超 (51)Int.Cl. C12N 15/113(2010.01)C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12Q 1/6818(2018.01) C12R 1/645(2006.01) (56)对比文件 CN 111363842 A,2020.07.0 3 CN 105483278 A,2016.04.13 CN 111394490 A,2020.07.10 CN 109295054 A,2019.02.01 CN 113122648 A,2021.07.16 US 20180 30516 A1,2018.02.01 张昆等.CRIS PR/Cas9技术在微生物研究中 的应用进 展. 《微生物学通报》 .2017,(第02期), 审查员 侯玮婷 (54)发明名称 马拉色菌的检测组合物、 试剂盒及其检测方 法 (57)摘要 本发明公开了一种 马拉色菌的检测组合物、 试剂盒及其检测方法。 本发明所提供的马拉色菌 检测引物组及试剂盒， 结合了RPA高效扩增与 CRISPR/Cas检测技术的特异靶向性优势， 具有扩 增效率高、 特异性强、 操作简单等特点， 与念珠 菌、 霉菌、 孢子丝菌等其他常见致病性真菌及人 类基因组DNA均无交叉反应。 本发明提供的试剂 盒所有检测步骤不依赖温度变化、 无需昂贵PCR 仪或复杂的变温条件， 因此反应速度更快、 成本 更低。 本发 明提供的试剂盒可直接用于检测临床 病原性真菌样本， 无需培养， 满足临床早期快速 精准诊断需求， 同时有助于快速鉴定常规形态学 或组织病理学难以鉴别的菌 株。 权利要求书1页 说明书9页 序列表6页 附图4页 CN 114075564 B 2022.04.22 CN 114075564 B 1.一种试剂盒， 其特征在于， 包括CRISPR/Cas检测体系和RPA扩增体系， 所述CRISPR/ Cas检测体系包括crRNA、 Cas蛋白和信号报告探针， 所述crRNA包括锚定序列片段和向导序 列片段， 所述向导序列片段的核苷酸序列如SEQ  ID NO.01、 SEQ  ID NO.03、 SEQ  ID NO.06、 SEQ ID NO.07、 SEQ  ID NO.10中的至少一种所示， 所述锚定序列片段的核苷酸序列如SEQ   ID NO.11所示； 所述锚定序列片段与所述Cas蛋白特异性结合； 所述信号报告探针的序列如 SEQ ID NO.34所示， 5 ’端标记有荧光报告基团， 3 ’端标记有荧光淬灭基团； 所述RPA扩增体 系包括上游引物片段和下游引物片段， 所述上游引物片段的核苷 酸序列如S EQ ID NO.27所 示， 所述下游引物片段的核苷酸序列如SEQ  ID NO.28所示。 2.根据权利要求1所述的试剂盒， 其特征在于， 所述荧光报告基团选自FAM、 VIC、 HEX、 ROX、 JOE、 Cy3、 Cy5中的一种。 3.根据权利要求1所述的试剂盒， 其特征在于， 所述荧光淬灭基团选自TAMRA、 BHQ ‑1、 BHQ‑2、 BHQ‑3中的一种。 4.根据权利要求1所述的试剂盒， 其特征在于， 所述CRISPR/Cas检测体系还包括NEB   Buffer、 乙酸镁激活剂、 磷酸肌酸、 肌酸激酶、 dNTPs、 ATP、 DTT、 醋酸钾、 重组酶UvsX、 重组酶 UvsY、 单链结合蛋白或Bsu聚合酶中的至少一种。 5.根据权利 要求1所述的试剂盒， 其特征在于， 所述RPA扩增体系还包括RPA酶预混液或 激活剂中的至少一种。 6.根据权利要求1所述的试剂盒， 其特征在于， 所述RPA扩增体系的反应温度为37~42 ℃。 7.权利要求1至 6任一项所述试剂盒在非疾病诊断目的鉴别马拉色菌种属中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114075564 B 2马拉色菌的检测组合物、 试剂盒及其检测方 法 技术领域 [0001]本发明涉及基因检测技术领域， 特别涉及一种马拉色菌 的检测组合物、 试剂盒及 其检测方法。 背景技术 [0002]马拉色菌相关疾病 （The M alassezia Genus in Skin and Systemic Diseases） 是一组由常见真菌感染引起的疾病， 如： 花斑糠疹 （pityriasis versicolor） 、 马 拉色菌毛 囊炎 （Malassezia folliculitis） 、 脂溢性皮炎 （seborrheic dermatitis） 、 特应性皮炎 （Atopic dermatitis） 、 银屑病 （Psoriasis） 等均与马拉色菌有着密切关联。 上述疾病不仅 仅危害各年龄层人群的身心 健康， 在各级医院中易出现误诊， 为患者、 社会及国家医保带来 巨大的经济负担。 以特应性皮炎、 银屑病为例， 据美国国家疾病控制中心公布数据， 特应性 皮炎平均自然人群患病率为 10%， 仅2015年美国特应性皮炎诊治成本 保守估计为52.97亿美 元。 银屑病是一种常见慢性皮肤病， 自然人群患病率约为3%， 约有 740万成年人患有 银屑病， 该疾病每年诊治费用支出估计为352亿美元。 因此， 马拉色菌相关疾病的防控关系着国家的 公共卫生安全， 早期快速、 精准 鉴定马拉色菌是及时诊断治疗马拉色菌感染疾病的关键 。 [0003]目前真菌感染性疾病的诊断主要依赖于对致病病原体的实验室检验， 传统实验室 诊断方法有： 真菌显微镜检 （KOH 法、 荧光染色法） 、 真菌分离培养、 组织病理检查。 其中， 真菌 分离培养及组织病理检查作为诊断真菌感染性疾病的金标准， 同样适用于马拉色菌感染， 但真菌分离培养往往有着鉴定周期 长、 阳性率低及形态学鉴定难度高等缺点； 因此， 如何实 现更加快速、 简便、 准确的检测， 是致病 病原体检测的未来发展方向。 发明内容 [0004]本发明目的在于提供一种马拉色菌 的检测组合物、 试剂盒及其检测方法， 以解决 现有技术中所存在的一个或多个技 术问题， 提供至少一种有益的选择或创造条件。 [0005]本发明的第一方面在 于提供了crRNA。 所述crRNA包括靠近5 ’端的锚定序列片段和 靠近3’端的向导序列片段， 所述向导序列片段的核苷酸序列如表1所示： [0006]表1 crRNA的向导序列说　明　书 1/9 页 3 CN 114075564 B 3