(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210046153.4 (22)申请日 2022.01.17 (71)申请人 福建农业职业 技术学院 地址 350304 福建省福州市福清市镜洋镇 官口溪兜1号 (72)发明人 林花　吴伯文　 (74)专利代理 机构 福州元创专利商标代理有限 公司 35100 专利代理师 林文弘　蔡学俊 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/645(2006.01) (54)发明名称 桃褐腐病菌LAMP检测引物及其应用 (57)摘要 本发明公开了一种桃褐腐病菌LAMP检测引 物及其应用， 本发明以桃褐腐病菌ITS基因为检 测靶标， 设计和筛选一套特异性检测的引物组， 其由4条特异性引物F3、 B3、 FIP、 BIP组成。 本发明 还提供了适用于该引物组的LA MP检测方法， 包括 以下步骤： 1） 提取待测样品DNA； 2） 使用本发明提 供的引物组合物对待测样品DNA进行环介导等温 扩增； 3） 结果检测， 在自然光照下反应产物为蓝 绿色， 并且在波长为365nm的紫外光照射下呈白 色浑浊沉淀状的判断为阳性。 本发 明解决了现有 技术检测周期长、 灵敏度不高、 特异性不强、 操作 复杂、 仪器设备要求高的缺陷， 能快速、 方便、 高 效、 高特异性、 高灵敏度、 低成本地检测到桃褐腐 病菌。 权利要求书1页 说明书8页 序列表1页 附图2页 CN 114703310 A 2022.07.05 CN 114703310 A 1.一种桃褐腐病菌LAMP检测引物， 其特 征在于， 其核苷酸序列为： F3： 5’ ‑CTTTTTATTAATGTCGTCTGAGTAC ‑3’； B3： 5’ ‑TACCAAGCTGTGCT TGAG‑3’； FIP： 5’ ‑ATTTCGCTGCGT TCTTCATCG‑TAGTTAAAACTTTCAACAACGGATC‑3’； BIP： 5’ ‑TGCAGAATTCAGTGAATCATCGA AT‑AAATGACGCTCGA ACAGG‑3’。 2.一种利用如权利要求1所述的引物进行桃褐腐病菌LAMP检测的方法， 其特征在于， 包 括以下具体步骤： 1） 提取待测样品基因 组DNA； 2） LAMP反应体系的建立： LAMP检测反应体系为25  μL， 以步骤1） 提取的DNA为模板， 反应 体系包括4  μM引物F3和B3各1.0  μL， 32 μM引物FIP和BIP各1.0  μL， LAMP反应混合液12.5 μ L， 8 U Bst聚合酶1.0  μL， DNA模板1.0  μL， 用灭菌超纯 水补足至25 μL； 3） LAMP反应条件： 64.5℃温育 60 min； 4） 反应结果的测定： 采用荧光染料目测观察法进行测定， 待LAMP 反应结束后， 将1.0  μL 显色剂SYBR  greenⅠ混合于LAMP反应的扩增产物中， 在自然光照下反应产物 为蓝绿色， 并且 在波长为365nm的紫外光照射下呈白色浑浊沉淀状的判断为阳性， 即存在桃褐腐病菌， 在自 然光照下反应产物为橙色或橘黄色， 并且在波长为365nm的紫外光照射下呈无色透明状的 判断为阴性， 即不存在 桃褐腐病菌； 其中， 所述的LAMP反应混合液由以下组分组成： 40mM  Tris‑HCl， 20mM  (NH4)2SO4， 20mM  KCl， 16mM  MgSO4， 1.6mo l/L甜菜碱， 2.0mM  dNTPs， 0.2 % TrionX‑100。 3.如权利要求1所述的桃褐腐病菌LAMP检测引物在桃褐腐病的早期诊断和病菌的监 测、 鉴定上的应用。 4.如权利要求2所述的桃褐腐病菌LAMP检测方法在桃褐腐病的早期诊断和病菌的监 测、 鉴定上的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114703310 A 2桃褐腐病菌LAMP检测引物及其应用 技术领域 [0001]本发明属于农作物病害检测、 鉴定及防治技术领域， 具体涉及桃褐腐病菌的LAMP 检测引物及其应用， 用于桃褐腐病菌的快速、 灵敏和特异分子检测， 同时可应用于桃褐腐病 的早期诊断和病菌的监测 和鉴定。 背景技术 [0002]由链核盘菌属真菌 （ Monilinia  spp. ） 侵染引起的桃褐腐病 是严重影响桃树产量 和质量的重要真菌病害之一， 该病害在世界范围内广泛分布， 在温润潮湿地区发生尤为严 重， 主要危害成熟果实， 造成大量烂果。 据报道， 引起桃褐腐病的病原真菌主要有3种， 即美 澳型核果褐腐菌 （ Monilinia  fructicola ） 、 核果褐腐菌 （ Monilinia  laxa） 和仁果褐腐菌 （Monilinia  fructigena ） 。 虽然3种病原菌均 可在桃上侵染引起褐腐病， 但3种病原菌的分 布和寄主偏好存在一定的差异， 其中美澳型核果褐腐菌 （ Monilinia  fructicola ） 在我国分 布范围最广， 是桃褐腐病菌优势菌群， 该病原菌能侵染所有李属 （ Prunus） 栽培作物， 除了危 害桃果实之外， 还危害李、 杏、 樱桃等核果类果树及苹 果和梨等仁果类果树， 侵染果树花、 茎 和果实， 引起花朵、 果实腐烂和枝条枯死， 发病严重地区， 果实采摘后的损失甚至高达90%， 导致严重的经济损失。 因此， 加强桃褐腐病防治， 对于挽 回经济损失、 提高果农收入和促进 桃产业健康发展等具有重要意 义。 [0003]病原菌的准确鉴定与前期检测是病害有效防控的基础， 病原菌传统的鉴定和检测 方法从发病组织中分离病原菌、 采用形态学特征对病原菌进行初步鉴定、 再通过柯赫氏法 则对病原菌进 行最终确定。 这种传统鉴定方法不仅耗时、 费力， 而且鉴定人员的经验还将 影 响结果的准确必， 显然不能满足病害大批量和准确鉴定需求。 随着科学技术的不断发展， PCR系列技术以其快速、 准确和特异 性强等优势在植物病害的鉴定、 诊断和快速检测中广泛 地得到了应用， 但该方法也存在了一些缺陷， 如需要依赖精密、 贵重的P CR扩增仪、 凝胶成像 系统等仪器 设备， 操作步骤较为复杂， 操作人员需具备一定的分子生物学技术等， 这些缺陷 使得该技术在经济欠发达地区和基层 农业部门的使用、 推广受到 很大的限制。 [0004]目前应用于植物病原微生物快速、 准确检测的最新技术为环介导等温扩增 （Loop ‑ mediated  Isothermal Amplification， LAMP） 技术。 该技术特异性强， 因为所设计的检测引 物是针对靶标基因6个特异区， 此外， LAMP方法对设备要求低， 仅需要简单的水浴锅或其它 加热设备， 同时该方法反应时间短， 具高效性， 整个反应在1小时内完成， 并且可用肉 眼观察 判断结果。 截至目前为止， 尚未见有LAMP技术用于桃褐腐病菌检测的相关报道。 本发明的目 就是设计桃褐腐病菌的LAMP检测引物， 并基于所设计引物的基础上， 建立桃褐腐病菌LAMP 检测体系。 发明内容 [0005]为解决现有技术中对桃褐腐病菌检测和鉴定主要基于形态学特征， 方法耗时长、 程序繁琐、 经验性强、 准确度低， 难以做到对病害发生的及时监测和控制病原菌的传播、 流说　明　书 1/8 页 3 CN 114703310 A 3