(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210046294.6 (22)申请日 2022.01.17 (71)申请人 中国医学 科学院药用植物研究所 地址 100193 北京市海淀区马连洼北路151 号 (72)发明人 宋经元　许文杰　辛天怡　娄千　 (74)专利代理 机构 北京慕达星云知识产权代理 事务所 (特殊普通合伙) 11465 代理人 崔自京 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 用于鉴别木通及其两种混伪品的微滴数字 PCR方法及应用 (57)摘要 本发明公开了用于鉴别木通及其两种混伪 品的微滴数字PCR方法及应用。 基于木通及其常 见混伪品关木通和川木通的ITS2序列分别设计 特异性引物和TaqMan探针， 开发单重和三重微滴 数字PCR技术。 单重微滴数字PCR技术能够分别特 异性检测木通、 川木通和关木通， 三重微滴数字 PCR技术可以一次性在同一PCR反应体系中同时 检测三种药材， 不同引物组之间没有相互干扰， 可用于市售 木通药材及相关中成药检测。 所述特 异性引物和TaqMan探针为SEQ  ID No.1‑9所示序 列。 该方法特异性强， 灵敏度高， 适用于痕量DNA 的检测， 可为中药质量控制和市场监管提供依 据， 保证中药安全性及有效性。 权利要求书2页 说明书7页 序列表3页 附图3页 CN 114350843 A 2022.04.15 CN 114350843 A 1.用于鉴别木通及其两种混伪品的微滴数字PCR方法及应用， 其特征在于， 所述方法涉 及特异性引物/ 探针序列及PCR反应 体系浓度如表1所示： 表1特异性引物/ 探针序列及PCR反应 体系浓度 2.根据权利要求1所述方法， 其特 征在于， 包括如下步骤： 步骤1.提取待检测样品基因 组DNA 步骤2.以待检测样品基因组DNA为模板， 采用权利要求1所述特异性引物/探针及体系 浓度配制木通、 关木通、 川木通单重或三重微 滴数字PCR反应 体系并进行扩增； 步骤3.对PCR扩增完成体系进行荧光读数， 根据阳性与阴性荧光点数目计算目的片段 拷贝数， 判断待检测样品是否为或含有木通及其两种常见混伪品。 3.根据权利要求2所述方法， 其特征在于步骤1所述待检测样品为任意一种形式的木 通、 川木通和关木通。 4.根据权利要求2所述方法， 其特征在于步骤2木通单重微滴数字PCR反应体系总体积 为20 μL， 包括： 10 μL ddPCR Supermix  for Probe(No  dUTP)， 0.4 μL  MT‑F， 0.4 μL MT‑R， 0.6 μ L MT‑P， 1 μL待检测样品DNA， 7.6 μL灭菌蒸馏水。 引物和探针初始浓度均为10 μM 。 5.根据权利要求2所述方法， 其特征在于步骤2关木通单重微滴数字PCR反应体系总体 积为20 μL， 包括： 10 μL ddPCR Supermix  for Probe(No  dUTP)， 0.4 μL  GMT‑F， 0.4 μL GMT‑R， 0.2 μL GMT‑P， 1 μL待检测样品DNA， 8 μL灭菌蒸馏水。 引物和探针初始浓度均为10 μM 。 6.根据权利要求2所述方法， 其特征在于步骤2川木通单重微滴数字PCR反应体系总体 积为20 μL， 包括： 10 μL ddPCR Supermix  for Probe(No  dUTP)， 0.4 μL  CMT‑F， 0.4 μL CMT‑R，权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114350843 A 20.6 μL CMT‑P， 1 μL待检测样品DNA， 7.6 μL灭菌蒸馏水。 引物和探针初始浓度均为10 μM 。 7.根据权利 要求2所述方法， 其特征在于步骤2三重微滴数字PCR反应体系总体积为20 μ L， 包括： 10 μL  ddPCR Supermix  for Probe(No  dUTP)， 0.6 μL  MT‑F/R， 0.45 μL  MT‑P， 0.6 μL  GMT‑F/R， 0.15 μL  GMT‑P， 0.6 μL CMT‑F/R， 0.45 μL  CMT‑P， 1 μL待检测样品DNA， 6.15 μL灭菌蒸 馏水。 引物和探针初始浓度均为10 μM 。 8.根据权利要求2所述方法， 其特征在于步骤2微滴数字PCR扩增条件参数为： 95℃， 5min； 95℃30s， 63℃1min， 40个循环； 98℃10mi n。 9.根据权利要求2所述方法， 其特征在于， 单重微滴数字PCR方法可分别特异性检测木 通、 川木通和关木通。 10.根据权利要求2所述方法， 其特征在于， 基于权利要求1中单重微滴数字PCR体系引 物和探针浓度比改变引物和探针浓度， 特异性检测木通、 川木通和关木通。 11.根据权利要求2所述方法， 其特征在于， 三重微滴数字PCR方法可以同一反应同时鉴 别木通、 川木通和关木通。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114350843 A 3