(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210049877.4 (22)申请日 2022.01.17 (71)申请人 南阳理工学院 地址 473000 河南省南阳市宛城区长江路 80号 (72)发明人 王春艳　宋建阳　邓洲　武思雨　 郭书贤　 (74)专利代理 机构 北京超凡宏宇专利代理事务 所(特殊普通 合伙) 11463 代理人 张金铭 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/645(2006.01) (54)发明名称 嗜热真菌的定量检测试剂盒、 检测方法及应 用 (57)摘要 本发明提供了嗜热真菌的定量检测试剂盒、 检测方法及应用， 涉及真菌检测技术领域。 本发 明通过提供嗜热真菌的特异性引物对、 检测试剂 盒以及相应的检测方法， 可用于检测和鉴定环境 如白酒酒醅中的嗜热真菌， 使用简单快捷、 特异 性好、 灵敏度高， 检测周期短。 权利要求书1页 说明书6页 序列表1页 附图6页 CN 114317808 A 2022.04.12 CN 114317808 A 1.一种用于检测嗜热真菌的引物对， 其特征在于， 所述嗜热真菌为嗜热丝孢菌属 (Thermomyces)真菌， 所述引物对的核苷酸序列如SEQ  ID No.1和SEQ ID No.2所示。 2.嗜热真菌的定量检测试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒包含权利要求1所述的引物 对。 3.根据权利要求2所述的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒还包括2 ×SYBR Green pro  TaqHS Premix， RNase ‑free Water和牛 血清蛋白。 4.根据权利要求3所述的试剂 盒， 其特征在于， 所述试剂 盒还包括系列浓度的嗜热丝孢 菌属(Thermo myces)真菌标准质粒DNA； 优选地， 所述标准质粒DNA的浓度包括10ng/ μL、 1ng/ μL、 0.1ng/ μL、 0.01ng/ μL、 0.0 01ng/ μL、 0.0 001ng/ μL和0.0 0001ng/ μL。 5.根据权利 要求4所述的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒中， 所述引物的浓度为10 μM； 所述牛血清蛋白的浓度为0.5mg/mL。 6.嗜热真菌的检测方法， 其特征在于， 使用权利要求1所述的引物对或权利要求2～5任 一项所述的试剂盒对待测样品进行PCR扩增。 7.根据权利要求6所述的检测方法， 其特征在于， 所述方法包括1)提取待检测样品的 DNA； 2)将获得的所述DNA作为模板， 进行实时荧 光定量PCR扩增检测。 8.根据权利要求7所述的检测方法， 其特征在于， 所述实时荧光定量PCR的扩增程序包 括： (1)预变性： 95℃， 5min； (2)循环反应： 95℃15s， 60℃30s， 72℃30s， 共30～50个循环； 于 72℃时测定荧 光值。 9.权利要求1所述的引物对或权利要求2～5任一项所述的试剂 盒在检测环境中的嗜热 丝孢菌属(Thermomyces)真菌中的应用。 10.根据权利要求9所述的应用， 其特征在于， 所述应用为检测白酒酒醅中的嗜热丝孢 菌属(Thermomyces)真菌 。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114317808 A 2嗜热真菌的定量 检测试剂盒、 检测方 法及应用 技术领域 [0001]本发明涉及真菌检测技术领域， 尤其是涉及 嗜热真菌 的定量检测试剂盒、 检测方 法及应用。 背景技术 [0002]嗜热真菌是一类最低生长温度为20℃或以上， 最高生长温度为50℃或以上的特殊 真菌类群， 它是真核生物中的极端生命类型， 是真核生物生长上限温度最高的生物。 嗜热真 菌在高温条件下表现出独特的生存适应能力和特殊的代谢产 物， 其产生的嗜热酶在高温条 件下具有很高的活性和热 稳定性。 [0003]中国传统白酒酿造工艺是利用粮食、 酒曲等原料进行固态发酵， 在酱香型和浓香 型白酒酒曲生产过程中都有大量嗜热真菌的参与。 董瑞丽等(中国酿造， 2011)通过分子生 物学的方法对浓香型的大曲进 行研究， 证实了在茅台酒生产过程中至少有三种嗜热真菌的 存在。 有研究表明， 大曲生产和堆积发酵都检测到嗜热真菌的存在(连宾， 地球与环境， 2004)。 李欣等(福建师范大学学报， 2017)研 究了酱香型白酒酒醅的微生物多样性， 发现嗜 热真菌属Thermomyces是酒醅发酵过程中产 酶的主要功能菌。 目前对白酒酿造环境中微生 物的研究方法主 要集中在 传统的纯培 养和免培 养技术。 [0004]现有技术中， 微生物种群的定量分析目前仍主要依靠传统计数， 由于环境中大多 数微生物的不可培养性， 传统计数法很难对复杂环境的微生物进行准确定量， 并且无法对 不同的微生物种群进 行区分与计数。 目前基于传统可培养技术从白酒酿造环境中分离筛选 Thermomyces的方法并未见报道。 近年来一些免培养技术， 如16S  rDNA高通量测序、 细胞磷 酸脂肪酸(PLFA)组分分析、 荧光原位杂交技术(Fluorescence  in situ hybridization， FISH)、 变性梯度凝胶电泳(Polymerase  Chain Reaction ‑Denaturing  Gradient  Gel  Electrophoresis,PCR ‑DGGE)等相继被用于白酒窖池微生物生态研究， 这些技术为揭 示微 生物菌群的多样性提供了强有力的手段， 但更多是针对微生物群落的定性或者半定量研 究。 最新报道的方法为加入内标菌对环境样本中的微生物进行绝对丰度检测， 但该方法结 果存在不确定性， 影响因素主要包括： 内标菌的选择、 内标菌的添加方式、 高通量对内标菌 种水平检测的误差等。 [0005]实时荧光定量PCR(qPCR)技术是根据菌群及特定基因设计相应引物， 从而在短时 间内得到研究对 象的准确拷贝数 的一种定量研究技术， 它 具有优越的灵敏度、 特异性和操 作简单的特点， 整个过程只需4h～5h。 针对白酒酿造环 境中微生物的研究， 也有 学者采用了 qPCR技术， 例如张劲(酿酒科技， 2014)研究了不同年龄阶段窖泥中主要产甲烷菌群； 胡贝 (应用与环境生物学报， 2014)研究了3个真细菌属和3个古细菌属在不同年份窖泥中的丰 度 ； 魏 娜 (应 用与 环 境 生 物 学 报 ， 2 0 1 5) 对白 酒 窖 泥中 的 优 势 菌 群 瘤胃 菌 (Ruminococcaceae)、 乳 杆菌(Lactobacillaceae)和毛螺旋菌(Lachno spiraceae)进行定量 分析； 张会敏(哈尔滨工业大学， 2017)对7个物种设计了定量引物； 胡晓龙等 (International  Journal  of Food Microbiology， 2015)对浓香型白酒窖泥中的说　明　书 1/6 页 3 CN 114317808 A 3