(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210048687.0 (22)申请日 2022.01.17 (71)申请人 武汉海希生物科技有限公司 地址 430205 湖北省武汉市东湖新 技术开 发区高新大道666号生物创新园B3-1 栋3层 (72)发明人 王芳　孙黎　郝玮　李小青　 (74)专利代理 机构 北京超凡宏宇专利代理事务 所(特殊普通 合伙) 11463 代理人 张金铭 (51)Int.Cl. C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 检测JAK2 基因V617F突变的引物和探针及其 应用和试剂盒 (57)摘要 本发明提供了一种检测JAK2 基因V617F突变 的引物和探针及其应用和试剂盒， 涉及生物技术 领域。 本发明提供的检测JAK2基因V617F突变的 引物和探针， 特异性好， 灵敏度高， 能够用于制备 检测JAK2基因V617F突变 的产品， 实现对JAK2基 因V617F突变位点的特异性扩增和检测。 本发明 提供的检测JAK2基因V617F突变的试剂盒， 特异 性高， 通过引入LNA封闭核苷酸序列用以选择性 抑制PCR中突变型探针对野生等位基因的非特异 性扩增； 灵敏度高， 最低可以检测到10ng基因组 背景下突变含量为0.5％的DNA样本； 能够实现单 孔检测， 操作简单。 权利要求书1页 说明书9页 序列表3页 附图3页 CN 114350767 A 2022.04.15 CN 114350767 A 1.一种检测JAK2基因V617F突变的引物和探针， 其特征在于， 所述引物包括JAK2基因 V617F突变型上游引物和JAK2基因V617F突变型下游引物， 所述JAK2基因V617F突变型上游 引物具有如SEQ  ID NO.1所示序列， 所述JAK2基因V617F突变型下游引物具有如SEQ  ID  NO.2所示序列； 所述探针为JAK2基因V617F突变型探针， 所述JAK2基因V617F突变型探针具有如SEQ  ID  NO.3所示序列。 2.根据权利要求1所述的引物和探针， 其特征在于， 所述JAK2基因V617F突变型探针的 5’端连接有荧 光报告基团， 3 ’端连接有荧 光猝灭基团； 所述荧光报告基团包括FAM或VIC中的至少一种； 所述荧光猝灭基团包括MGB。 3.权利要求1或2所述的引物和探针在制备检测JAK2基因V617 F突变产品中的应用。 4.一种检测JAK2基因V617 F突变的试剂盒， 其特 征在于， 包括DNA聚合酶和反应液； 所述反应液包括Buffer、 Mg2+、 dNTP、 LNA封闭核苷酸序列以及权利要求1或2所述的引物 和探针； 所述LNA封闭核苷酸序列具有如SEQ  ID NO.7所示序列。 5.根据权利要求 4所述的试剂盒， 其特 征在于， 所述DNA聚合酶包括高保真酶； 优选地， 所述Buf fer包括Tris ‑HCl缓冲液。 6.根据权利要求4所述的试剂盒， 其特征在于， 所述反应液还包括内参引物和内参探 针。 7.根据权利要求6所述的试剂 盒， 其特征在于， 所述内参引物包括内参上游引物和内参 下游引物； 所述内参上游引物具有如SEQ  ID NO.4所示序列， 所述内参下游引物具有如SEQ  ID  NO.5所示序列； 所述内参探针具有如SEQ  ID NO.6所示序列。 8.根据权利要求7所述的试剂盒， 其特征在于， 所述内参探针的5 ’端连接有荧光报告基 团， 3’端连接有荧 光猝灭基团； 所述荧光报告基团包括FAM或VIC中的至少一种， 但选择与JAK2突变型探针不相同的荧 光报告基团； 所述荧光猝灭基团包括MGB。 9.根据权利要求 4所述的试剂盒， 其特 征在于， 还 包括阳性对照； 所述阳性对照包括阳性质粒和内参质粒； 优选地， 所述阳性对照为含有阳性质粒和内参质粒的TE溶液， 其中， 内参质粒的浓度为 1‑5ng/ μL， 优选为1.8ng/ μL； 阳性质粒的浓度为0.1 ‑0.5ng/ μL， 优选为0.2ng/ μL； 优选地， 所述阳性对照的制备方法包括： 分别将所述阳性质粒和内参质粒的浓度用TE 稀释到2ng/ul， 制备得到阳性质粒溶液和内参质粒溶液； 然后将阳性质粒溶液和内参质粒 溶液按照体积比为1:9混合， 制备 得到阳性对照。 10.根据权利要求 4所述的试剂盒， 其特 征在于， 还 包括空白对照； 所述空白对照包括无核酸酶水。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114350767 A 2检测JAK2基因V617 F突变的引物和探针及其应用和试剂盒 技术领域 [0001]本发明涉及生物技术领域， 尤其是涉及一种检测JAK2基因V617F突变的引物和探 针及其应用和试剂盒。 背景技术 [0002]目前用于JA K2基因V6 17F突变检的技术和专利文献较多， 有一代测序、 高分辨溶解 曲线法和AS ‑PCR。 一代测序是SNP检测的金标准， 但检测过程时间长、 操作繁琐、 检测灵敏度 低， 检测下限仅为20％。 高分辨溶解曲线法由于操作复杂和技术本身的局限性， 因而不适合 在临床广泛推广。 AS ‑PCR作为一种快速、 便捷和灵敏度高的方法成为定性检测JAK2  V617F 突变位点的主要检测手段， 然而其检测灵敏度在1％左右。 因此， 针对JAK2基因V617F突变， 还缺少一种灵敏度高的检测方法。 [0003]有鉴于此， 特提出本发明。 发明内容 [0004]本发明的第一目的在于提供一种检测JAK2基因V617F突变的引物和探针， 以解决 上述问题中的至少一种。 [0005]本发明的第二目的在于提供上述引物和探针在制备检测JA K2基因V6 17F突变产品 中的应用。 [0006]本发明的第三目的在于提供一种检测JAK2基因V617 F突变的试剂盒。 [0007]第一方面， 本 发明提供了一种检测JA K2基因V6 17F突变的引物和探针， 所述引物包 括JAK2基因V617F突变型上游引物和JAK2基因V617F突变型下游引物， 所述JAK2基因V617F 突变型上游引物具有如SEQ  ID NO.1所示序列， 所述JAK2 基因V617F突变型下游引物具有如 SEQ ID NO.2所示序列； [0008]所述探针为JAK2基因V617F突变型探针， 所述JAK2基因V617F突变型探针具有如 SEQ ID NO.3所示序列。 [0009]作为进一步技术方案， 所述JAK2基因V617F突变型探针的5 ’端连接有荧光报告基 团， 3’端连接有荧 光猝灭基团； [0010]所述荧光报告基团包括FAM或VIC中的至少一种； [0011]所述荧光猝灭基团包括MGB。 [0012]第二方面， 本发明提供了上述引物和探针在制备检测JAK2基因V617F突变产 品中 的应用。 [0013]第三方面， 本发明提供了一种检测JAK2基因V617F突变的试剂盒， 包括DNA 聚合酶 和反应液； [0014]所述反应液包括Buf fer、 Mg2+、 dNTP、 LNA封闭核苷酸序列以及上述引物和探针； [0015]所述LNA封闭核苷酸序列具有如SEQ  ID NO.7所示序列。 [0016]作为进一 步技术方案， 所述DNA聚合酶包括高保真酶；说　明　书 1/9 页 3 CN 114350767 A 3