(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210055184.6 (22)申请日 2022.01.18 (71)申请人 秦皇岛市食品药品检验中心 地址 066000 河北省秦皇岛市海港区和安 路11号 (72)发明人 刘珊珊　赵冬梅　付欢　朱娜　 孙雅君　王志成　刘浩　 (74)专利代理 机构 北京贵都专利代理事务所 (普通合伙) 11649 专利代理师 李新锋 (51)Int.Cl. C12Q 1/6888(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种荧光定量PCR检测双壳贝类源性 成分的 方法 (57)摘要 本发明公开了一种荧光定量PCR检测双壳贝 类源性成分的方法， 首先称取样品， 对样品进行 DNA提取， 并通过引物进行PCR扩增， 再将扩增后 的产物进行琼脂糖凝胶电泳得到电泳条带， 将目 的条带切割回收送测序公司测序， 测序结果输入 NCBI网站进行BLAST比对， 得到物种信息和相关 目的基因序列， 将每个双壳贝类的目的基因序列 下载， 利用DNA MAN软件进行比对得到已获得贝类 品种的相同基因序列， 针对上述目的序列设计引 物和Taqman探针， 送公司合成引物和探针， 利用 市售贝类样品进行引物探针验证， 双壳贝类可检 出。 本发明对样品进行DNA提取， 利用特异性引物 探针进行实时荧光定量PCR扩增， 根据扩增曲线 和CT值判定样品中是否含有双壳贝类成分， 能够 有效对食品中的贝类成分进行种类 检测。 权利要求书2页 说明书5页 CN 114457167 A 2022.05.10 CN 114457167 A 1.一种荧 光定量PCR检测双壳贝类源性成分的方法， 其特 征在于， 检测步骤如下： 1)称选样品； 2)对样品进行DNA提取： 称 取0.3g已制备好的样品于2mL离心管中， 加入 1000 μL CTAB缓 冲液和40 μL蛋白酶K， 振荡混匀， 65℃30min， 期间每隔10min振荡混匀； 12000g离心10min， 转 移1mL上清液于2mL离心管中； 加500 μL酚、 三氯甲烷和异 戊醇的混合液， 体积比为25： 24:1， 强烈振荡， 12000g离心15min； 吸取上清液到新的2mL离心管中， 加入等体积的异丙醇， 振荡 均匀， 12000g离心10min； 去除上清液， 用预热至65℃的TE缓冲 液溶解DNA； 加入5 μLRNA酶溶 液， 37℃30min。 加入2 00 μL三氯甲烷 ‑异戊醇(24:1)， 强烈振荡， 12 000g离心15min； 吸取上清 液至一新离心管中， 加入等体积异丙醇， 振荡均匀， 12000g离心10min； 弃去上清液， 70％乙 醇洗涤一次， 120 00g离心1mi n。 弃上清液， 晾干； 加入5 0 μLTE缓冲液， 溶解DNA沉淀； 3)利用通用引物对DNA提取 液进行PCR扩增， 得到扩增产物； 4)将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳得到电泳条 带， 并选择目的条 带； 5)将目的条 带切割回收送测序公司测序； 6)测序结果输入NCBI网站进行BLAST比对， 得到物种信息和相关目的基因序列， 将每个 双壳贝类的目的基因序列下 载； 7)利用DNAMAN软件进行比对得到已获得贝类 品种的相同基因序列， 此序列为检测双壳 贝类的目的序列； 8)针对上述目的序列设计引物和Taqman探针， 送公司合成引物和探针； 9)利用市售贝类样品进行引物探针验证， 双壳贝类可检出双壳贝类特异序列。 2.根据权利要求1所述的一种荧光定量PCR检测双壳贝类源性成分的方法， 其特征在 于， 所述步骤9)中的双壳贝类特异序列CTGAGACAACTCTATGCGGTGGATCACTCGGCTCGTGCGTCGA TGAAGAGCGCAGCCAGCTGCGTGAATTAATGTGAATTGCA GGACACACTGAACATCGACACCTTGAACGCACATTG CGGCTCTGGCTCACTGC CAGAGCCACGCCTGTCCGAGGGTCGGCGAACAAGTCATCG。 3.根据权利要求1所述的一种荧光定量PCR检测双壳贝类源性成分的方法， 其特征在 于， 所述步骤9)中引物探针序列为： F： 5’CTATGCGGTGGATCACTCG G 3’； R： 5’CGCAATGTGCGT TCAAGGTG3’； P： FAM‑5’ATGAAGAGCGCAGC CAGCTGCGTGA3 ’ ‑TAMRA。 4.根据权利要求1所述的一种荧光定量PCR检测双壳贝类源性成分的方法， 其特征在 于， 所述步骤9)中引物探针检测双壳贝类成分的具体步骤如下： 引物探针检测双壳贝类成 分的具体步骤如下： 1)样品DNA提取， 测定DNA的浓度和纯度。 DNA纯度A260/A280在1.7～1.9之间为适宜， 将 DNA浓度稀释到10～10 0ng/ μL； 2)荧光定量PCR体系和程序如下： 体系： 2×PCR缓冲液， 12.5 μL； 正向引物(10 μM)， 0.75 μL； 反向引物(10 μM)， 0.75 μL； 荧光 探针(10 μM)， 0.5 μL； DNA模板， 2 μL； RNase ‑FreeddH2O， 补足至25 μL； 程序： 为95℃15mi n预变性； 95℃变性1sec， 6 0℃退火3 0sec， 40个 循环； 检验过程中分别设阳性对照、 阴性对照、 空白对照， 样品及对照均设两个重复， Ct值取 两个重复的平均值作为 最终结果；权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114457167 A 23)结果判断： 以下条件有一条不满足时， 实验视为无效： (a)空白对照： 无荧 光对数增长， 相应的Ct值＞40.0； (b)阴性对照： 无荧 光对数增长， 相应的Ct值＞40.0； (c)阳性对照： 有荧 光对数增长， 且荧 光通道出现典型的扩增曲线， 相应的Ct值＜3 0.0； (d)内参照： 有荧 光对数增长， 且荧 光通道出现典型的扩增曲线， 相应的Ct值＜3 0.0； 在符合上述的情况 下， 被检样品进行检测时： 如Ct值≤ 35.0， 则判定为被 检样品阳性； 如Ct值≥40.0， 则判定为被 检样品阴性； 如35.0＜Ct值＜40.0， 则重复一次。 如再次扩增后Ct值仍＜40.0， 则判定被检样品阳 性； 如再次扩增后Ct值 仍≥40.0， 则判定被 检样品阴性。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114457167 A 3