(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210058865.8 (22)申请日 2022.01.18 (71)申请人 复旦大学附属中山医院 地址 200032 上海市徐汇区枫林路180号 (72)发明人 朱同玉　王吉妍　 (74)专利代理 机构 上海容慧专利代理事务所 (普通合伙) 31287 代理人 于晓菁 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 用于BK病毒LAMP检测的试剂盒 (57)摘要 本发明提供了基于环介导的等温扩增 (LAMP)技术进行BK病毒检测的方法， 用于 所述方 法的引物组及相应试剂盒。 利用所述引物组能够 特异性的环介导等温扩增BK病毒。 本发 明方法特 异性好、 灵敏度高、 重复性好、 操作简单、 方便快 捷， 可良好地应用于鉴定BK病毒， 适用于临床和 实验室检测。 权利要求书1页 说明书7页 序列表6页 附图2页 CN 114107571 A 2022.03.01 CN 114107571 A 1.一种BK病毒环介导等温扩增检测引物组， 其特征在于， 所述引物组选自BK1、 BK2、 BK3、 BK4或BK5； 所述BK1引物组包括： 序列如SEQ  ID NO:1所示的F3， 序列如SEQ  ID NO:2所示的B3， 序 列如SEQ ID NO:3所示 的FIP， 序列如SEQ  ID NO:4所示 的BIP， 序列如SEQ  ID NO:5所示的 LB； 或， 所述BK2引物组包括： 序列如SEQ  ID NO:6所示的F3， 序列如SEQ  ID NO:7所示的B3， 序 列如SEQ ID NO:8所示的FIP， 序列如SEQ  ID NO:9所示的BIP， 序列如SEQ  ID NO:10所示的 LB； 或， 所述BK3引物组包括： 序列如SEQ  ID NO:11所示的F3， 序列如SEQ  ID NO:12所示的B3， 序列如SEQ  ID NO:13所示的FIP， 序列如SEQ  ID NO:14所示的BIP， 序列如SEQ  ID NO:15所 示的LF， 序列如SEQ  ID NO:16所示的LB； 或， 所述BK4引物组包括： 序列如SEQ  ID NO:17所示的F3， 序列如SEQ  ID NO:18所示的B3， 序列如SEQ  ID NO:19所示的FIP， 序列如SEQ  ID NO:20所示的BIP， 序列如SEQ  ID NO:21所 示的LB； 或， 所述BK5引物组包括： 序列如SEQ  ID NO:22所示的F3， 序列如SEQ  ID NO:23所示 的B3， 序列如SEQ  ID NO:24所示的FIP， 序列如SEQ  ID NO:25所示的BIP， 序列如SEQ  ID NO: 26所示的LB； 其中， F3、 B3为外引物， FIP、 BIP为内引物， LF、 LB为环引物。 2.权利要求1所述的引物组在制备BK病毒检测试剂或试剂盒中的应用。 3.包含权利要求1所述的引物组的试剂或试剂盒。 4.根据权利要求3所述的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒进一步包含反应缓冲液， DNA 聚合酶， BK病毒阳性对照。 5.权利要求1所述的引物组、 权利要求3或4所述的试剂或试剂盒在样品中BK病毒检测 中的应用； 优选地， 所述检测为非诊断治疗目的 的。 6.根据权利要求5所述的应用， 其特征在于， 包括如下步骤： a.将待测样品及对照样品 加入恒温扩增体系进 行扩增； b.反应结束， 采集被检样 本、 阳性对照、 阴性对照的荧光信号； c.结果判定 。 7.根据权利要求6所述的应用， 其特征在于， 所述步骤a中恒温扩增体系包括待测样品、 10×恒温扩增缓冲液、 MgS04、 dNTP、 引物 F3、 引物B3、 引物 FIP、 引物BIP、 引物LB、 Bst聚合酶、 无核酸酶水。 8.根据权利要求6或7所述的应用， 其特征在于， 所述步骤a中进行扩增反应温度为50 ‑ 65℃， 反应时长为10 ‑60min。 9.根据权利要求6所述的应用， 其特 征在于， 所述对照包括阳性对照和阴性对照。 10.根据权利要求6所述的应用， 其特征在于， 所述步骤c中结果判定的方法为： ①阳性 对照： 有典型的S型扩增曲线出现， 终点荧光值高于等于起点荧光值3倍以上， 为有效结果； ②阴性对照： 无扩增曲线 出现， 或终点荧光值低于起点荧光值的3倍， 为有效结果； ③被检样 本： a.若终点荧光值高于等于起点荧光值3倍以上， 判断为阳性； b.若终点荧光值低于起点 荧光值的3倍， 判断为阴性。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114107571 A 2用于BK病毒LAMP检测的试剂盒 技术领域 [0001]本发明属于分子生物学和核酸检测技术领域， 尤其是涉及基于环介导的等温扩增 BK病毒引物组、 试剂盒及检测方法。 背景技术 [0002]人BK病毒(BK  virus， BKV)是基因组大约5300bp的无囊膜环状双链DNA病毒， 与人 JC病毒(JC  virus,JCV)、 猴SV40病毒同属于多瘤病毒家族(polyo maviruses)。 BKV人群感染 率超过85％， 但有临床症状者常限于免疫功能缺陷的个体。 BKV的原发感染多发生在儿童时 期， 随后在泌尿系统潜伏感染， BKV潜伏感染也见于淋巴组织及肝、 肺、 眼、 脑等处。 BKV是机 会性病原体， 免疫正常的人群无感染症状， 当宿 主免疫功能降低或受到抑制时BKV可重新活 化并致病。 器官移植术后长期服用免疫抑制剂导致患者免疫功能低下是BKV活化的主要诱 因。 大约6％的肾移植患者因BKV感染引发BKV相关性肾病(BKVN)， 其中50 ‑70％的BKVN患者 最终导致移 植肾失去功能。 BKV N已成为肾移 植术后最严重的并发症及影响肾移 植病人长期 生存和功能的关键因素之一。 BKV的感染还与造血干细胞移 植患者的出血性膀胱炎， 进 行性 多灶性脑白质 病、 肺部疾病、 肿瘤、 自身免疫性疾病 等相关。 而目前临床上对BKVN除降低免 疫抑制外无有效的抗病毒手段， 而免疫抑制强度降低又容易诱发器官排斥。 因此， BKV感染 的早期诊断对肾移植患者预后具有重要临床意 义。 [0003]BKVN诊断的金标准是肾组织活检， 联合肾小管间质肾炎表现、 血清肌酐升高等确 诊BKVN。 由于BKV N病灶的局限性导致准确取样困难， 灵敏度会受到影响。 并且肾组织穿刺带 有创伤性， 不易被病人接受。 同时肾组织活检还要排除急性排斥反应， 药物毒性和其他潜在 疾病的影响。 患者BKV激活复制后尿液首先表现为病毒尿症， 可通过尿液decoy细胞镜检判 断。 Decoy细胞为来源于尿道上皮的脱落细胞， 显微镜下可见核内病毒包涵体及细胞病变效 应。 但这种方法受限于尿液病理差异及尿道结构的个体差异， 结果判定主观， 难以做到标准 化。 荧光定量PCR检测血液、 尿液中BKV的DNA， 被认为是 目前最适合用于肾移植术后监测病 人发生BKVN的无创诊断方法。 但由于缺乏统一检测标准， 不同检测 体系造成了结果差异较 大， 无法进行横向比较， 病毒拷贝数 的阈值无法达成共识， 给报告解读带来一定困扰。 现有 用于检测BKV的方法大都检测周期长， 速度慢， 而且检测准确度不高， 所以我们急需能够实 现快速、 有效且准确检测BKV的产品， 以用于BKV的检测。 [0004]环介导等温扩增(LAMP)是一种在等温条件下特异性快速扩增DNA的新型技术。 不 同于PCR， LAMP技术使用2 ‑3对引物和具有链置换活性的Bst  DNA聚合酶来识别目标基因中 的六个不同区域。 目标序列在60 –65℃恒温下扩增， 60分钟内扩增效率高达109–1010。 执行 LAMP检测只需要一个恒温模块， 避免了PCR的热循环 需求。 LAMP检测技术具有高灵敏度、 特 异性、 便利性和高效率的特 征， 已被广泛用于病原体诊断。 [0005]综上， 开发基于环介导的等温扩增BK病毒的引 物组、 试剂盒及相应 的检测方法在 本领域具有重要意 义。说　明　书 1/7 页 3 CN 114107571 A 3