(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210055074.X (22)申请日 2022.01.18 (71)申请人 无锡中德美联生物技 术有限公司 地址 214174 江苏省无锡市惠山区文惠路 18-1 (72)发明人 胡琦　陈林丽　何小用　赵鹏　 刘伟　王靖元　 (74)专利代理 机构 南京经纬专利商标代理有限 公司 32200 专利代理师 余俊杰 (51)Int.Cl. C12Q 1/6883(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 联合检测人SMN1和SMN2基因的试剂盒及其 应用 (57)摘要 本发明公开了联合检测人SMN1和SMN2基因 的试剂盒及其应用， 所述试剂盒包括扩增17个基 因座的特异性引物。 与现有技术相比， 本发明具 有以下优点： 克服MLPA检测平台操作复杂、 耗时 长、 检测成本高； qPCR检测平台检测通量小、 单拷 贝鉴定不够准确等问题， 本发明选用多重荧光 PCR平台结合拷贝数校准内标并结合毛细管电泳 的技术平台， 建立了可同时检测SMN1、 SMN2全部 外显子及5处 “2+0”型携带者相关性SNP位点的准 确区分SMA健康人群、 携带者及患者的检测方法。 为SMA的诊断提供更加便捷、 准确、 高性价比的选 择方案。 权利要求书2页 说明书12页 序列表9页 附图2页 CN 114480620 A 2022.05.13 CN 114480620 A 1.联合检测人SMN1和SMN2基因的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒包括扩增17个基因 座的特异性引物， 其中基因座为同时检测S MN1和SMN2基因同源的外显子1至外显子6的以下 7个基因座： Exon1、 Exon2a、 Exon2b、 Exon3、 Exon4、 Exon5、 Exon6； 和特异性检测 SMN1基因外 显子7和8的以下2个基因座： SMN1 ‑Exon7、 SMN1 ‑Exon8； 和特异性检测SMN2基因外显子7和8 的以下2个基因座： SMN2 ‑Exon7、 SMN2 ‑Exon8； 和检测 “2+0型”携带者相关性SNP的以下5个基 因座： g.116 78G>T、 g.22804G>A、 g.26190A>G、 g.27 134T>G、 g.27706 ‑27707del AT； 以及检测 内参基因ACTB。 2.根据权利 要求1所述的联合检测人SMN1和 SMN2基因的试剂盒， 其特征在于， 所述扩增 17个基因座的特异性引物的序列如下： Exon1、 SEQ  ID NO.1‑2； Exon2a、 SEQ  ID NO.3‑4； Exon2b、 SEQ  ID NO.5‑6； Exon3、 SEQ  ID NO.7‑8； Exon4、 SEQ  ID NO.9‑10； Exon5、 SEQ  ID  NO.11‑12； Exon6、 SEQ  ID NO.13‑14； SMN1‑Exon7、 SEQ  ID NO.15‑16； SMN2‑Exon7、 SEQ  ID  NO.17‑18； SMN1‑Exon8、 SEQ  ID NO.19‑20； SMN2‑Exon8、 SEQ  ID NO.21‑22； ACTB、 SEQ  ID  NO.23‑24； g.11678G>T、 SEQ  ID NO.25‑27； g.22804G>A、 SEQ  ID NO.28‑30； g.26190A>G、 SEQ   ID NO.31‑33； g.27134T>G、 SEQ  ID NO.34‑37； g.27706 ‑27707delAT、 SEQ  ID NO.38‑39； 其 中SMN1‑Exon8、 SMN2 ‑Exon8及g.27706 ‑27707delAT共用下游引物， g.27134T与SMN1 ‑Exon7 共用下游引物， g.27134G与SMN2 ‑Exon7共用下游引物。 3.根据权利 要求1所述的联合检测人SMN1和 SMN2基因的试剂盒， 其特征在于， 所述扩增 17个基因座 的特异性引物的浓度如下： SEQ  ID NO.1‑2、 0.15μM； SEQ  ID NO.3‑4、 0.18 μM； SEQ ID NO.5‑6、 0.18 μM； SEQ  ID NO.7‑8、 0.25 μM； SEQ  ID NO.9‑10、 0.20 μM； SEQ  ID NO.11‑ 12、 0.35 μM； SEQ  ID NO.13‑14、 0.20 μM； SEQ  ID NO.15、 0.30 μM； SEQ  ID NO.16、 0.40 μM； SEQ   ID NO.17、 0.25 μM； SEQ  ID NO.18、 0.36 μM； SEQ  ID NO.19、 0.18 μM； SEQ  ID NO.20、 0.35 μM； SEQ ID NO.21、 0.18 μM； SEQ  ID NO.22、 0.35 μM； SEQ  ID NO.23‑24、 0.15 μM； SEQ  ID NO.25‑ 27、 0.20 μM； SEQ  ID NO.28‑30、 0.20 μM； SEQ  ID NO.31‑33、 0.20 μM； SEQ  ID NO.34、 0.20 μM； SEQ ID NO.35、 0.40 μM； SEQ  ID NO.36、 0.20 μM； SEQ  ID NO.37、 0.36 μM； SEQ  ID NO.38、 0.10 μM； SEQ ID NO.39、 0.3 5 μM。 4.根据权利 要求1所述的联合检测人SMN1和 SMN2基因的试剂盒， 其特征在于， 所述特异 性引物的5 ’端采用以下荧光染料标记： FA M、 HEX、 TET、 TA MRA、 ROX、 VIC、 NED、 ATTO系列或CY系 列。 5.根据权利 要求1所述的联合检测人SMN1和 SMN2基因的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂 盒包括一套拷贝 数校准质粒， 每个外显子基因座及内参基因ACTB均有对应的拷贝 数校准质 粒。 6.根据权利 要求5所述的联合检测人SMN1和 SMN2基因的试剂盒， 其特征在于， 所述拷贝 数校准质粒序列如下： I ‑SMN1‑Exon8、 SEQ  ID NO.40； I‑SMN2‑Exon8、 SEQ  ID NO.41； I‑ Exon1、 SEQ  ID NO.42； I‑ACTB、 SEQ  ID NO.43； I‑Exon6、 SEQ  ID NO.44； I‑Exon2a、 SEQ  ID  NO.45； I‑Exon4、 SEQ  ID NO.46； I‑Exon2b、 SEQ  ID NO.47； I‑Exon5、 SEQ  ID NO.48； I‑SMN1‑ Exon7、 SEQ ID NO.49； I‑SMN2‑Exon7、 SEQ ID NO.50； I‑Exon3、 SEQ ID NO.51。 7.根据权利 要求5所述的联合检测人SMN1和 SMN2基因的试剂盒， 其特征在于， 所述拷贝 数校准质粒扩增子片段长度如下： I ‑SMN1‑Exon8、 82bp； I ‑SMN2‑Exon8、 90bp； I ‑Exon1、 97bp； I‑ACTB、 110bp； I ‑Exon6、 122bp； I ‑Exon2a、 149bp； I ‑Exon4、 164bp； I ‑Exon2b、 176bp；权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114480620 A 2I‑Exon5、 192bp； I‑SMN1‑Exon7、 205bp； I‑SMN2‑Exon7、 212bp； I ‑Exon3、 217bp。 8.根据权利 要求1所述的联合检测人SMN1和 SMN2基因的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂 盒包括多重荧光PCR反应缓冲液， 其组份及各组份反应浓度为： 50mM  Tris‑HCl； 40mM  KCl； 1.8mM MgCl2； 0.22mM dUTP； dATP/dGTP/dCTP/dTTP各0.18mM； 甘油8.0％； 1.8mg/mL  BSA； 10mM TC； UNG酶0.04U/ μL； 热启动DNA ‑Taq酶0.80U/ μL。 9.权利要求1 ‑8任一所述联合检测人SMN1和SMN2基因的试剂盒在检测脊髓性肌肉萎缩 症中的应用。 10.根据权利要求9所述的应用， 其特征在于， 检测的样本包括外周血、 whatman唾液卡 或whatman血卡。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114480620 A 3