(19)国家知识产权局 (12)发明 专利 (10)授权公告 号 (45)授权公告日 (21)申请 号 202210055843.6 (22)申请日 2022.01.18 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 114410818 A (43)申请公布日 2022.04.29 (73)专利权人 广东省农业科 学院蔬菜研究所 地址 510640 广东省广州市天河区金颖路 66号 (72)发明人 刘文睿　孙飘云　闫晋强　王毅　 谢大森　江彪　王敏　杨松光　 罗陈　史绍琪　 (74)专利代理 机构 广州知友专利商标代理有限 公司 44104 专利代理师 宣国华　刘艳丽(51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (56)对比文件 CN 111793713 A,2020.10.20 CN 108866226 A,2018.1 1.23 王日勇等.基 于重测序‘墨地龙’冬瓜InDel 标记的开发及纯度鉴定. 《分子植物育种》 .2021, 第19卷(第20期),676 0-6766. Dasen Xie等.The wax gourd gen omes offer insights i nto the genetic diversity and ancestral cucurbit karyotype. 《NAT URE COMMUNICATIONS》 .2019,第10卷(第1期),5158. 审查员 张丽华 (54)发明名称 一种与冬瓜果实大小紧密连锁的Indel分子 标记引物及其应用 (57)摘要 本发明公开了一种与冬瓜果实大小紧密连 锁的Indel 分子标记引物， 所述Indel 分子标记引 物包括上游引物BhFS ‑F和下游引物Bh FS‑R， 其中 所述上游引物BhFS ‑F的核苷酸序列如SEQ  ID  NO.1所示， 所述下游引物Bh FS‑R的核苷酸序列如 SEQ ID NO.2所示。 该引物能产生168bp的大果特 异性标记BhFS168和173bp的小果特异性标记 BhFS173， 且重复性好、 特异性强。 还公开了所述 Indel分子标记引物在苗期鉴定冬瓜果实大小表 型方面的应用。 该应用利用所述Indel分子标记 引物， 能准确、 快速、 有效的鉴定冬瓜果实大小。 权利要求书1页 说明书5页 序列表1页 附图1页 CN 114410818 B 2022.10.11 CN 114410818 B 1.一种与冬瓜果实大小紧密连锁的Indel分子标记引物， 其特征是： 所述Indel分子标 记引物包括上游引物BhFS ‑F和下游引物BhFS ‑R， 其中所述上游引物BhFS ‑F的核苷酸序列如 SEQ ID NO.1所示， 所述下游引物BhFS ‑R的核苷酸序列如SEQ  ID NO.2所示。 2.根据权利要求1所述的Indel分子标记引物， 其特征是： 所述Indel分子标记引物根据 位于冬瓜第10号染色体1680999 6‑16906354的96.358kb区间内的控制冬瓜果实大小的基因 设计获得。 3.权利要求1中所述 Indel分子标记引物在苗期鉴定冬瓜果实大小表型 方面的应用。 4.根据权利要求3所述的应用， 其特 征是包括以下步骤： (1)提取冬瓜新鲜叶片的基因 组DNA； (2)以冬瓜 基因组DNA为模板， 使用权利要求1中的I ndel分子标记引物进行PCR扩增； (3)将PCR扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳； (4)对电泳结果进行分析， 该Indel分子标记引物能产生如SEQ  ID NO.3所示 的大小为 168bp的大果型亲本B227特异性标记FS168以及如SEQ  ID NO.4所示的大小 为173bp的小果型 亲本HF3特异性标记FS173， 其中大果对小果为显性， 同时具有两个亲本特异性标记FS168和 FS173的单株或单独具有大果型亲本B227特异性标记FS168的单株， 其表型与大果亲本一致为 大果， 单独具有 小果型亲本HF3特异性标记FS173的单株， 其表型为小果。 5.根据权利要求4所述的应用， 其特征是： 步骤(2)中PCR扩增时采用的20 μL反应体系包 括： 浓度为100ng ·μL‑1的基因组DNA  1μL， 含Mg2+的10×PCR buffer 2μL， 浓度为2.5mM的 dNTPs 1.5 μL， 浓度为0.25mmol ·L‑1的上游引物BhFS ‑F 1μL， 浓度为0.25mmol ·L‑1的下游 引物BhFS ‑R 1 μL， Taq酶1U， 余 量为ddH2O。 6.根据权利要求4所述的应用， 其特征是： 步骤(2)中PCR扩增时采用的扩增程序包括： 94℃预变性3min后， 94℃变性30s， 55℃退火30s， 72℃延伸1min， 35个循环后， 72℃终延伸 7min， 4℃保存。 7.根据权利要求4所述的应用， 其特征是： 步骤(3)中聚丙烯酰胺凝胶电泳时采用质量 百分含量 为8％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114410818 B 2一种与冬瓜果实大小紧密连锁的Indel分子标记引物及其 应用 技术领域 [0001]本发明属于分子生物学技术领域， 具体涉及一种与冬瓜果实大小紧密连锁的 Indel分子标记引物及其应用。 背景技术 [0002]果实大小是冬瓜重要的农艺性状， 直接决定冬瓜 的产量。 果实大小是果实完全成 熟后的农艺性状， 且易受环境影响， 是性状改良中的难点。 常规育种需要在果 实成熟后对果 实大小进行鉴定， 耗时长、 成本高。 通过构建遗传群体， BSA ‑seq初定位， 进一步利用大群体 对标记进行加密， 进行精细定位并获得与果实大小共分离的分子标记， 通过标记辅助选择 技术可显著 提高果实大小的选择效率、 在苗期即对果 实大小进 行选择， 节省育种用地， 加快 育种进程。 发明内容 [0003]本发明的目的在于提供一种与冬瓜果实大小紧密连锁的Indel分子标记引物， 该 引物能产生168bp的大果特异性标记BhFS168和173bp的小果特异性标记BhFS173， 且重复性 好、 特异性强。 [0004]本发明的目的还在于提供上述Indel分子标记引物在苗期鉴定冬瓜果实大小表型 方面的应用， 利用所述 Indel分子标记引物， 能准确、 快速、 有效的鉴定冬瓜果实大小。 [0005]本发明的上述第一个目的可以通过以下技术方案来实现： 一种与冬瓜果实大小紧 密连锁的Indel分子标记引物， 所述Indel分子标记引物包括上游引物BhFS ‑F和下游引物 BhFS‑R， 其中所述上游引物Bh FS‑F的核苷酸序列如SEQ  ID NO.1所示， 所述下游引物BhFS ‑R 的核苷酸序列如SEQ  ID NO.2所示。 [0006]具体的， 该I ndel分子标记引物的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如下： [0007]BhFS‑F： 5’ ‑aaacatcaagacgaacaacc’(SEQ ID NO.1所示)； [0008]BhFS‑R： 5’ ‑gaacgacatactc ccaacat’(SEQ ID NO.2所示)。 [0009]采用该Indel分子标记引物进行PCR扩增， 带型清晰、 重复性好， 经特异性片段(聚 丙烯酰胺非变性胶)回收DNA—P CR扩增—琼脂糖胶回收—TA克隆测序后， 分析结果可知： 该 Indel分子标记引物能产生168bp的大果亲本B227特异性标记FS168和173bp的小果亲本HF3 特异性标记FS173。 [0010]优选的， 所述Indel分子标记引物根据位于冬瓜第10号 染色体16809996 ‑16906354 的96.358kb区间内的控制冬瓜果实大小的基因设计获得。 [0011]本发明以大果型冬瓜B22 7与小果型冬瓜HF3为亲本构建4世代分离群体， 研究果实 大小的遗传规律， 结果显示在该群体中， 果 实大小为一对核基因控制的质量性状， 大果对小 果为显性。 随后， 通过F2群体中的极端大小果实单株构建基 因池， 进行BSA ‑seq， 将果实大小 基因初步定位于第10号染色体。 进一步构建包含1486个单株的F2群体进行标记加密， 将果说　明　书 1/5 页 3 CN 114410818 B 3