(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210052462.2 (22)申请日 2022.01.18 (66)本国优先权数据 PCT/CN2021/13 5965 2021.12.07 CN (71)申请人 深圳市先康达生命科 学有限公司 地址 518106 广东省深圳市福田区福田街 道福山社区彩田路2048号福建大厦B 座1403 (72)发明人 谢海涛　马丽雅　都晓龙　王乃会　 (51)Int.Cl. C12N 15/85(2006.01) C12N 15/113(2010.01) C12N 15/11(2006.01) A61K 48/00(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称 一种基因生物制剂及其制备方法和应用 (57)摘要 本发明涉及一种基因生物制剂及其制备方 法和应用， 该基因生物制剂的蛋白基因中使用基 因编辑技术敲入一段IN044序列， 致使蛋白基因 中目标基因沉默， 达到基因敲除效果。 应用本发 明中方法对目的基因编辑后， 一则因为移码突变 目的基因无法翻译为蛋白， 二则即使产生蛋白则 会被快速降解， 杜绝不明性状的翻译蛋白产生的 毒性。 本发明应用前景广泛， 可用于基因编辑、 疾 病诊断和治 疗等各方面。 权利要求书1页 说明书7页 序列表1页 附图7页 CN 114369621 A 2022.04.19 CN 114369621 A 1.一种基因敲除插序方法， 其特征在于， 向膜表达型蛋白的胞外段或分泌型的蛋白基 因中， 通过基因编辑的方式插 入一段IN044核酸序列； 所述 IN044核酸序列为： AACTGCCGGAATACCGGCCCCTGGCTGAAGAAGGTGCTGAAGTGTAACACACCCGACCCTAGCAAGTTCTTT TCCCAGCTG。 2.根据权利要求1所述的基因敲除插序方法， 其特征在于， 所述IN044核酸序列对应氨 基酸序列为： NCRNTGPW LKKVLKCNTP DPSKFFSQL。 3.根据权利要求1所述的基因敲除插序方法， 其特征在于， 所述IN044核酸序列通过合 成一段DNA序列后对 靶细胞进行基因插 入。 4.根据权利要求3所述的基因敲除插序方法， 其特征在于， 所述DNA序列通过直接加入 方式插入靶细胞基因序列中。 5.根据权利要求1所述的基因敲除插序方法， 其特征在于， 使用基因编辑技术敲除任意 位置的基因序列。 6.根据权利要求5所述的基因敲除插序方法， 其特征在于， 所述基因编辑技术包括 CRISPR、 转座子、 TALEN和ZFN 技术中的一种或多种。 7.根据权利要求6所述的基因敲除插序方法， 其特征在于， 所述基因编辑技术中的基因 或蛋白和gRNA是通过递送载体转入所述靶细胞中。 8.根据权利 要求7所述的基因敲除插序方法， 其特征在于， 所述传递载体包括DNA、 RNA、 质粒、 纯化蛋白、 慢病毒、 腺病毒、 逆转录病毒及转 座子中的一种或几种。 9.一种根据权利要求1至8任一项所述基因敲除插序方法制得的基因生物制剂。 10.权利要求9所述基因生物制剂在制备、 预防以及治疗肿瘤和/或癌症疾病药物中的 应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114369621 A 2一种基因生物制剂及其制备方 法和应用 技术领域 [0001]本发明涉及基因编辑、 生物细胞技术领域， 特别是涉及一种基因生物制剂及其制 备方法和应用。 背景技术 [0002]近几年来， 基因编辑技术发展迅速， 尤其是CRISPR ‑cas9， CRISPR(Clustered   regularly  interspaced  short palindromicrepeats)规律成簇间隔短回文重复； Cas9 (CRISPR associated  nuclease)是CRISPR相关核酸酶， CRISPR ‑Cas9是最新出现的一种由 RNA指导的， 利用Cas9核酸酶对靶向基因进行编辑的技术。 2013年2月15日发表在 《科学》 (Science)的两篇文章， 证明Cas9系统能在293T,K562,iPS等多种细胞中， 进行有 效的靶向 酶切， 且非同源重组(NHEJ)及同源重组(HR)各自效率在3 ‑25％之间， 重组效率与TALEN剪切 效果相当。 文章还证明， 多个靶点可以同时进行靶向剪切。 这些工作将进一步靶向基因操纵 推向高潮， 使得多个 基因敲除、 敲入变得 更为简单、 高效。 [0003]经过多年研究， Cas9核酸酶对靶向基因进行编辑技术已趋于成熟。 可实现对目标 基因的定点突变、 基因敲除和基因敲入。 目前， 该技术在动植物育种、 干细胞定向分化、 遗传 疾定点修复等领域得到迅 猛发展。 [0004]一般情形下， CRISPR ‑Cas9基因敲除技术中， 使用一条gRNA靶向目标序列进行基因 剪切， 并利用修复时的缺失， 进行基因剪切， 增加碱基， 造成移码突变， 导致基因沉默； 还有 一种情形， 使用两条gRNA靶向目标序列进行基因剪切， 造成基因片段缺失， 导致基因沉默。 但这两种方法均可能出现一个 问题： 即使造成基因移码或基因片段缺失， 但基因仍旧可以 正常表达出蛋白的情况， 此时基因所表达的蛋白为非原始野生型蛋白， 其功 能及性状都可 能发生改变， 这种基因有可能引发其 他副作用产生。 发明内容 [0005]基于此， 有必要针对上述问题， 提供一种基因敲除插序方法， 通过优化方式使目的 基因被剪切后产生可翻译蛋白， 且敲除基因可以被降解掉并使其无害化。 本发明还提供使 用基因敲除插序方法制得的基因生物制剂及其应用。 [0006]本发明提供的技 术方案一如下： [0007]一种基因敲除插序方法， 该方法是在靶细胞的膜表达型蛋白的胞外段或分泌型蛋 白中， 使用基因编辑技术， 敲除表达型蛋白的胞外段或分泌型蛋白的基因序列并在该敲除 基因序列位置插 入一段IN044核酸序列； 所述 IN044核酸序列为： [0008]AACTGCCGGAATACCGGCCCCTGGCTGAAGAAGGTGCTGAAGTGTAACACACCCGACCCTAGCAAGTT CTTTTCCCAGCTG； [0009]其中， 所述基因编辑 技术包括CRIS PR、 转座子、 TALEN和ZFN 技术中的一种或多种。 [0010]将所述IN044核酸序列插入膜表达型蛋白的胞外段基因序列， 或将所述IN044核酸 序列插入分泌 型蛋白的任意位置序列， 主要 是对靶细胞中插序后的基因起到完全沉默及蛋说　明　书 1/7 页 3 CN 114369621 A 3