(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210054100.7 (22)申请日 2022.01.18 (71)申请人 浙江自贸区锐赛 生物医药 科技有限 公司 地址 316100 浙江省舟山市普陀区东港街 道海印路1055号普陀全民健身中心3 号楼6层-2 （自贸试验区内） (72)发明人 王荣　张腾　罗卫峰　宋文文　 (74)专利代理 机构 上海三方专利事务所(普通 合伙) 31127 专利代理师 钱品兴 (51)Int.Cl. C12Q 1/6886(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种用于宫颈癌 甲基化检测的引物和探针 组合、 试剂盒及其使用方法 (57)摘要 本发明一种用 于宫颈癌 甲基化检测的引物 和探针组合、 试剂盒及其使用方法， 所述引物和 探针用于检测PAX 1、 EPB41L3和FAM19A4的基因组 合； 所述引物和探针组合包括PAX1正向引物F、 PAX1反向引物R、 PAX1探针P、 EPB41L3正向引物F、 EPB41L3反向引物R、 EPB41L3探针P、 FAM19A4正向 引物F、 FAM19A4 反向引物R和FAM19A4探针P； 他们 的核苷酸序列分别如SEQ  ID NO： 1～SEQ  ID NO： 9所示。 本发明采用的探针具有高特异性和高敏 感性的优势， 可准确稳定的检测出低至浓度1ng/ μL， 5％甲基化率； 并且所述探针具有单碱基分 辨率， 可特异区分甲基化和未甲基化的DNA。 权利要求书2页 说明书9页 序列表3页 附图1页 CN 114457156 A 2022.05.10 CN 114457156 A 1.一种用于宫颈癌甲基化检测的引物和探针组合， 其特征在于， 所述引物和探针用于 检测PAX1、 EPB41L3和FAM19A4的基因组合； 所述引物和探针组合包括PAX1正向引物F、 PAX1 反向引物R、 PAX1探针P、 EPB41L3正向引物F、 EPB41L3反向引物R、 EPB41L3探针P、 FAM19A4正 向引物F、 FA M19A4反向引物R和FA M19A4探针P； 所述PAX 1正向引物F、 PAX1反向引物R、 PAX 1探 针P、 EPB41L3正向引物F、 EPB41L3反向引物R、 EPB41L3探针P、 FA M19A4正向引物F、 FA M19A4反 向引物R和FAM19 A4探针P的核苷酸序列分别如SEQ  ID NO： 1～SEQ  ID NO： 9所示。 2.根据权利要求1所述的一种用于宫颈癌甲基化检测的引物和探针组合， 其特征在于， 所述PAX1探针P、 EPB41L3探针P和FAM19A4探针P的5 ’端采用FAM标记； 所述PAX1探针P、 EPB41L3探针P和FAM19 A4探针P的3 ’端采用MGB标记。 3.一种用于宫颈癌甲基化检测的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒包括权利要求1或2 所述的引物和探针组合、 β ‑actin正向引物F、 β ‑actin反向引物R和β ‑actin探针P； 所述β ‑ actin正向引物F、 β ‑actin反向引物R和β ‑actin探针P的核苷酸序列如SEQ  ID NO： 10～SEQ   ID NO： 12所示。 4.根据权利要求3所述的一种用于宫颈癌甲基化检测 的试剂盒， 其特征在于， 所述β ‑ actin探针P的5 ’端采用VIC标记； 所述β ‑actin探针P的3 ’端采用MGB标记。 5.根据权利要求3或4所述的一种用于宫颈癌甲基化检测的试剂盒， 其特征在于， 所述 试剂盒还 包括10×PCR Buffer， Taq酶、 dNTPs、 无核酸酶水、 阳性对照和阴性对照。 6.根据权利要求5所述的一种用于宫颈癌甲基化检测的试剂 盒， 其特征在于， 所述阳性 对照包括 来自宫颈癌细胞株CaSk i的DNA； 所述阴性对照包括 来自宫颈癌细胞株C 33A的DNA。 7.一种如权利要求3～6任一所述试剂盒的使用方法， 其特 征在于方法包括以下步骤： 1) 提取待检样本DNA； 2) 将所述待检样本DNA经重亚硫酸盐转 化处理， 得到转 化后的DNA； 3) 以所述转化后的DNA为模板， 利用如权利要求2或3所述的引物和探针组合进行PCR 扩增反应， 得到荧 光检测结果； 4) 利用所述荧光检测结果， 对待检样本进行判定， 当β ‑actin Ct≤34， 根据PAX1、 EPB41L3和FAM19A4基因的ΔCt 计算各个基因的甲基化指数 （MI） ， PAX1基因ΔCt＞5， PAX1基 因的MI=0， 2≤ΔCt≤5， PAX1基因的RI=1， ΔCt＜2， PAX1基因的RI=2， FAM19A4基因ΔCt＞ 0.5， FAM19A4基因的MI=0， ‑0.5≤ΔCt≤0.5， FAM19A4基因的RI=1， ΔCt＜ ‑0.5， FAM19A4基 因的RI=2， EPB41L3基因ΔCt＞6， EPB41L3基因的MI=0， 6≤ΔCt ≤3， EPB41L3基因的MI=1， Δ Ct＜3， EPB41L3基因的MI=2， 3个基因的MI值相加得到总MI值， 总 MI值≥5， 则判定样本为宫 颈癌甲基化阳性， 总MI值＜5， 则判定样本为宫颈癌甲基化阴性； 当β ‑actin Ct＞34， 则判定 样本不足或有抑制物存在， PCR反应无效， 需重复实验或采样； 所述Δ Ct＝FAM Ct‑VIC Ct。 8.根据权利要求7所述的使用方法， 其特征在于， 步骤3)中所述PCR扩增反应使用的反 应体系包括PAX1扩增体系 、 EPB41L3扩增体系和FAM19 A4扩增体系； 所述PAX1扩增体系以20 μL计包括： PAX1  PCR反应液18.8 μL、 Taq酶0.2 μL和转化后的DNA   1 μL； 所述PAX 1 PCR反应液包括以下浓度的组分： 1 ×PCR Buffer、 0.2 5mM dNTP、 0.4uM  PAX1 正向引物F、 0.4uM  PAX1反向引物R、 0.4uM  PAX1探针P、 0.4uM  β‑actin正向引物F、 0.4uM  β‑ actin反向引物R和0.4uM  β‑actin探针P； 所述EPB41L3扩增 体系以20 μL计包括： EPB41L3  PCR反应液18.8 μL、 Taq酶0.2 μL和转化权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114457156 A 2后的DNA 1μL； 所述EPB41L3  PCR反应液包括以下浓度的组分： 1 ×PCR Buffer、 0.25mM   dNTP、 0.4uM  EPB41L3正向引物F、 0.4uM  EPB41L3反向引物R、 0.4uM  EPB41L3探针P、 0.4uM   β‑actin正向引物F、 0.4uM  β‑actin反向引物R和0.4uM  β‑actin探针P； 所述FAM19A4扩增 体系以20 μL计包括： FAM19A4  PCR反应液18.8 μL、 Taq酶0.2 μL和转化 后的DNA 1μL； 所述FAM19A4  PCR反应液包括以下浓度的组分： 1 ×PCR Buffer、 0.25mM   dNTP、 0.4uM  FAM19A4正向引物F、 0.4uM  FAM19A4反向引物R、 0.4uM  FAM19A4探针P、 0.4uM   β‑actin正向引物F、 0.4uM  β‑actin反向引物R和0.4uM  β‑actin探针P。 9.根据权利 要求7所述的使用方法， 其特征在于， 步骤3)中所述PCR扩增反应的程序为： 95℃ 5min， [95℃ 15s、 60℃ 30s， 40个循环]， 反应结束； 所述6 0℃ 30s过程中采集 荧光。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114457156 A 3