(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210053698.8 (22)申请日 2022.01.18 (71)申请人 贵州省水稻研究所 地址 550006 贵州省贵阳市花溪区贵州省 农科院水稻研究所 (72)发明人 王忠妮　王倩　吴娴　朱速松　 (74)专利代理 机构 北京安信方达知识产权代理 有限公司 1 1262 专利代理师 张晨　牛利民 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种鉴定水稻Badh2基因型的引物组、 方法 和试剂盒 (57)摘要 本申请涉及鉴定水稻Badh2基因型的引物 组， 所述引物组包括(1)上游引物ex on7‑2‑F和任 选地选自以下的下游引物Xiang7R、 intron7R、 INTRON8R1或INTRON8R2； 或者(2)引物组BADH2G ‑ F、 BADH2G‑1R和badh2G‑2R。 引物的具体序列如说 明书定义。 本申请还涉及用于鉴定水稻Badh2基 因型的方法和试剂盒。 权利要求书1页 说明书8页 附图4页 CN 114480706 A 2022.05.13 CN 114480706 A 1.用于鉴定水稻Badh2基因型的引物组， 包括 第一引物组， 包括上游引物exon7 ‑2‑F： CTGGTAAAAAGATTATGGC和任选地选 自以下的下 游引物： Xiang7R： CATCA AACACCACTATAG GAC； intron7R： AACTGGCTACTAGA ATGATG； INTRON8R1： TCGTCTG GGACCAGTATTTC； 或 INTRON8R2： CAGTACA AGATCTGCTCA A； 或者 第二引物组， 包括上游引物BADH2G ‑F： GCTTGCTGATGTGTGTAA； 下游引物BADH2G ‑1R： TTTCCACCAAGTTCCAGT和下游引物badh2G ‑2R： GAGCAGCTGA AGCCATAA。 2.一种鉴定水稻Badh2基因型的方法， 包括： (1)提取水稻的DNA； (2)使用根据权利要求1所述的引物组进行PCR扩增； 和 (3)鉴定水稻Badh2基因型。 3.根据权利要求2所述的方法， 其中， 用CTAB法提取 水稻的DNA。 4.根据权利要求3所述的方法， 其中， PCR扩增的反应 体系为10 ‑50 μL。 5.根据权利要求4所述的方法， 其中当使用第一引物 组且所述PCR扩增的反应体系为20 μL时， 所述反应体系包括50ng/ μL的DNA模板0.1 ‑2 μL、 10 μM的上游引物0.2 ‑1 μL、 10 μM的下游 引物0.2‑1μL、 10xBuffer  2 μL、 2.5mM  dNTPs 1‑2 μL和5U/ μL  rTaq酶0.1 ‑0.5 μL， 补充ddH2O 至20 μL。 6.根据权利要求5所述的方法， 其中所述PCR扩增的反应程序为94℃或95℃3 ‑5min； 94 ℃30s、 50‑60℃30s、 72℃10 ‑40s， 共30‑40个循环； 72℃5 ‑10min； 优选地， 其中所述PCR扩增的反应程序为95℃ 5min； 94℃30s、 55℃ 30s、 72℃40s， 共30循 环； 72℃10mi n。 7.根据权利 要求5或6所述的方法， 其中产生扩增条带的样品是来自Badh2显性的样品， 为非香稻； 不产生扩增条 带的样品是来自badh2隐性的样品， 为 香稻。 8.根据权利要求4所述的方法， 其中， 当使用第二引物组且所述PCR扩增的反应体系为 20 μL时， 所述反应体系包括50ng/ μL的DNA模板0.1 ‑2 μL、 10 μM的引物B ADH2G‑F 0.2‑2 μL、 10 μ M的引物badh2G ‑2R 0.1‑1μl， 10μM的引物BADH2G ‑1R 0.1‑1μl、 10xBuffer  2μL、 2.5mM   dNTPs 1‑2 μL和5U/ μL  rTaq酶0.1 ‑0.5 μL， 补充ddH2O至20 μL， 并且 反应体系中， 引物BADH2G ‑ F的浓度为引物badh2G ‑2R和BADH2G ‑1R的2倍。 9.根据权利要求8所述的方法， 其 中， 所述PCR扩增的反应程序 为94℃或95℃3 ‑5min； 94 ℃或95℃3 0s、 50‑60℃30s、 72℃10 ‑40s， 共30‑40个循环； 72℃5 ‑10min； 优选地， 其中所述PCR扩增的反应程序为95℃ 3min； 95℃30s、 50℃～58℃ 30s、 72℃ 30s， 共30个循环； 72℃5mi n。 10.根据权利要求8或9所述的方法， 其中产生两条扩增条带的样品是来自Badh2显性的 样品， 为非香稻； 产生 一条扩增条 带的样品是来自badh2隐性的样品， 为 香稻。 11.一种用于鉴定水稻Badh2基因型的试剂盒， 包括 根据权利要求1所述的引物组。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114480706 A 2一种鉴定水稻Badh2基因型的引物组、 方 法和试剂盒 技术领域 [0001]本发明属于分子检测技术领域， 具体涉及一种鉴定水稻Badh2基因两种基因型的 引物组、 方法和试剂盒。 背景技术 [0002]随着生活水平的提高， 人们对稻米食味品质及风味(口感和香味)的要求越来越 高。 香稻因其具有香气馥郁、 米饭芬芳等特点， 深 受广大消费者的喜爱(Bradbury  et al., 2005； Myint et al., 2012)。 [0003]鉴定香稻的常规方法是通过KOH浸泡叶片闻味， 或者咀嚼稻米， 确定香味。 在选育 香稻的过程中， 子代数量很多， 劳动量大。 [0004]前人对水稻香味的遗传研究认为水稻香味是由单个隐性基 因控制的， 精细定位及 图位克隆研究表明水稻第8号染色体上的甜菜碱醛脱氢酶2基因  (betaine  aldehyde   dehydrogenase  homologue  2,Badh2)与香味密切相关(Ahn  et al.,1992； Lorieux  et  al.,1996； Bradbury  et al.,2005)。 研究表明， 非香型水稻中的Badh2基因为显性， 香型水 稻(香稻)中的badh2基因是隐性的。 [0005]通过对各地香稻资源的研究发现， Badh2基因存在多种等位型， 其中最常见的类型 是Badh2基因的第7外显子有1个8bp的缺失和3个单核苷酸多态性位点(图1， 缺失用 “.”表 示， 单核苷酸多态性用灰色表示)。 市场上的香稻的基因型多为此基因型， 因此需要相应的 分子标记用于检测香稻和非香稻的基因型。 [0006]目前已有一些针对Badh2基因的第7外显子的缺失设计的引物， 用于区分香型与非 香型水稻Badh2基因型。 利用这些引物扩增得到的PCR片段仅相差8bp， 故 需要用高浓度的琼 脂糖(3％)或者6％聚丙烯 酰胺电泳进行区分。 高浓度的琼脂糖(3％)或者6％聚丙烯酰胺电 泳的缺点在于制作过程复杂， 电泳时间长， 条带不易区分。 以利用6％聚丙烯酰胺凝胶电泳 为例， 制备凝胶耗时约3小时， 并且由于待测片段的差异仅有8bp， 需要电泳1.5 ‑2h， 然后需 要染色1h左右， 总计耗时需要4 ‑5小时。 [0007]Louis M.T.Bradbury等人(Louis  M.T.Bradbury  et al.,2005)公开了一组用于 分析水稻香型的引物， 包括外部正向(ESP)、 外部反向(EAP)、 内部香味反向(IFAP)和内部非 香味正向(INSP)4种引物。 由于该方法在同一个反应中用四个引物同时扩增， 劳动强度大， 且对于扩增条件要求较高， 例如需要准确控制引物的浓度、 退火温度等条件， 否则可能导致 实验失败(即无扩增条 带)。 发明内容 [0008]为了更容易地区分Badh2基因型， 发明人设计了一种针对水稻Badh2基因外显子7 的引物exon7 ‑2‑F。 发明人将香稻与非香稻中的差异序列  AAAAGATTATGGC设计在上游引物 的3’端， 以此引物与下游引物进行扩增时， 非香稻(即含有Badh2基因)可以扩增得到280bp 的目的条 带， 香稻(含有badh2基因)无 条带。说　明　书 1/8 页 3 CN 114480706 A 3