(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210055981.4 (22)申请日 2022.01.18 (71)申请人 承德医学院 地址 067000 河北省承 德市上二道河子 (72)发明人 刘金霞　杨思煕　任立群　李冉　 王丽娜　 (74)专利代理 机构 郑州慧广知识产权代理事务 所(特殊普通 合伙) 41160 代理人 朱广存 (51)Int.Cl. C12Q 1/6844(2018.01) C12Q 1/689(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (54)发明名称 LAMP检测OXA48家族基因的引物组合物、 试 剂盒及检测方法 (57)摘要 本发明涉及一种LAMP检测耐碳青霉烯酶阴 沟肠杆菌OXA48家族基因的引物组合物、 相应的 试剂盒及检测方法， 选择OXA48家族的共同基因 片段， 其中包含blaOXA‑48、 blaOXA‑181、 blaOXA‑232、 blaOXA‑204、 blaOXA‑162、 blaOXA‑244， 设计环介导等温 扩增体系 中所需引物， 对反应体系、 反应条件以 及染色剂浓度等进行反复优化， 建立改良的 OXA48家族LAMP检测的试剂盒。 该LAMP检测试剂 盒不仅可以检测阴沟肠杆菌的OXA48家族基因， 还可以推及其他细菌， 只要含有该耐药基因的细 菌均可以检测到。 由于LAMP检测试剂盒操作简 便， 操作风险低。 权利要求书1页 说明书7页 序列表2页 附图4页 CN 114350761 A 2022.04.15 CN 114350761 A 1.一种LAMP检测耐碳青霉烯酶阴沟肠杆菌OXA48家族基因的引物组合物， 其特征在于： 所述的LAMP引物组合物包括： 正向外引物F3： 如SEQ  ID NO： 1所示， 反向外引物B3： 如SEQ  ID NO： 2所示； 正向内引物FIP： 如SEQ  ID NO： 3所示； 反向内引物BIP： 如SEQ  ID NO： 4所示； 正向环引物LF： 如SEQ  ID NO： 5所示； 反向环引物LB： 如SEQ  ID NO： 6所示。 2.一种用于检测耐碳青霉烯酶阴沟肠杆菌OXA48家族基因的LAMP试剂盒， 其特征在于： 包括如权利要求1所述的LAMP检测耐碳青 霉烯酶阴沟肠杆菌OXA48家族基因的引物组合物。 3.根据权利 要求2所述的LAMP试剂盒， 其特征在于： 所述LAMP检测耐碳青霉烯酶阴沟肠 杆菌OXA48家族基因的引物组合物包括0.2 μM正向外引物F3， 0.2 μM反向外引物B3， 1.6 μM正 向内引物FIP， 1.6 μM反向内引物BIP， 0.4 μM正向环引物LF， 0.4 μM反向环引物LB。 4.根据权利要求3所述的LAMP试剂盒， 其特 征在于： 还 包括LAMP反应扩增液。 5.根据权利 要求4所述的LAMP试剂盒， 其特征在于： 所述LAMP 反应扩增液包括0.2M甜菜 碱、 6mM MgSO4、 1.4mM  dNTPs、 8U  Bst DNA聚合酶、 2.5 μl的10 ×buffer、 1 μl模板DNA、 0.05mM 钙黄绿素、 0.6mM  MnCl2、 7.1 μl无菌d dH20。 6.一种LAMP检测耐碳青霉烯酶阴沟肠杆菌OXA48家族基因的方法， 其特征在于， 利用权 利要求2‑5任一项所述的LAMP试剂盒进行检测。 7.根据权利 要求6所述的LAMP检测耐碳青霉烯酶阴沟肠杆菌OXA48家族基因的方法， 其 特征在于， 按照如下的步骤顺序进行： (1)在反应管中加入0.2 μM正向外引物F3、 0.2 μM反向外引物B3、 1.6μM正向内引物FIP、 1.6 μM反向内引物BIP、 0.4 μM正向环引物、 0.4 μM反向环引物、 0.2 M甜菜碱、 6mM  MgSO4、 1.4mM   dNTPs、 8U  Bst DNA聚合酶、 2.5μl的10 ×buffer、 1μl模板DNA、 0.05mM钙黄绿素、 0.6mM   MnCl2、 7.1 μl无菌d dH20， 并将反应管置 于恒温水浴锅中； (2)将步骤(1)的反应管置 于冰盒上终止反应， 根据反应管中颜色变化判断扩增结果。 8.根据权利 要求6所述的LAMP检测耐碳青霉烯酶肠杆菌OXA48家族基因的方法， 其特征 在于： 所述恒温水浴箱的温度6 3‑67℃， 反应时间为25 ‑30分钟。 9.根据权利 要求6所述的LAMP检测耐碳青霉烯酶肠杆菌OXA48家族基因的方法， 其特征 在于： 所述恒温水浴箱的温度为6 5℃， 反应时间为25 ‑30分钟。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114350761 A 2LAMP检测OXA 48家族基因的引物组合物、 试剂盒及检测方 法 技术领域 [0001]本发明属于分子检测技术领域， 涉及一种引物组合物、 试剂盒和检测方法， 具体地 说是一种 LAMP检测耐碳青霉烯酶阴沟肠杆菌OXA48家族基因的引物组合物、 相应的试剂盒 及检测方法。 背景技术 [0002]肠杆菌科细菌是社区和医院感染中的常见病原菌之一， 20世纪80年代以来， 碳青 霉烯类抗菌药物一直被认为是对抗产超广谱β －内酰胺酶(ESBLS)和AmpC酶肠杆菌感染的 最有效手段， 但近年来临床上抗菌药物的过度使用导致耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌(CRE) 的产生， 并在 全球范围内呈广泛流行的趋势。 碳青碳青霉烯酶是碳青霉烯水解内酰胺酶， 主 要包括KPC丝氨酸β ‑内酰胺酶， NDM、 IMP、 VIM 金属β‑内酰胺酶与OXA48类金属β ‑内酰胺酶。 这 些碳青霉烯类耐药基因通常存在于质粒， 使其能够在细菌间快速传播。 因此， 建立一种快 速， 特异性强， 灵敏度高的诊断方法， 对于耐碳青 霉烯类细菌的防治具有重要意 义。 [0003]目前， 耐碳青霉烯类细菌的主要诊断方法有改良霍奇实验(MHT)， Carba  NP试验 (CNP)， 碳青霉烯类灭活试验(CIM)， 流式细胞术(FC)， 基质辅助激光解析电离飞行时间质谱 技术(MALDI ‑TOF‑MS)与核酸扩增等方法。 改良霍奇实验所用试剂价格便宜， 操作简便， 在 2010年美国和临床实验室标准化协会(CLSI)推荐其为CRE表型确证实验， 但其耗时长且难 以解释某些结果， 不 能区分酶类型， 2018年已从M100 ‑S28文件中删除； Carba  NP试验(CNP) 快速， 准确， 但试验操作繁杂， 需特殊试剂， 不适合在常规实验室开展； 碳青霉烯灭活试验 (CIM)操作简单， 价格低廉， 试剂易获得， 但所需时间较长， 不能进行快速检测； 流式细胞术 (FC)具有 可定量分析、 简 便、 耗时短等优点， 但 其所需设备昂贵， 未在常规实验室开展； 基质 辅助激光解析电离飞行时间质谱技术是一种快速、 低成本、 高通量的CRE检测方法， 但其只 能检测产酶CRE， 且质谱仪价格昂贵， 方法尚未标准化； 以核酸扩增为基础的实验技术， 具有 快速， 灵敏， 特异性强的特点， 比如PCR、 LAMP等。 但因PCR技术对操作人员技能有较高要求， 需要的热循环设备价格昂贵而难以推广， 环介导等温扩增 技术克服了上述缺点， 具有反应 快速， 操作简单 的优势， 一台水浴锅等恒温设备即可操作， 扩增结果可用肉眼进行判定， 对 员工简单培训即可完成操作， 适合在基层医疗机构中应用。 但PCR， LAMP等分子生物学检测 法是针对CRE的碳青霉烯酶 中的型别进行检测。 如今的LAMP检测技术已日趋成熟， 国内外 关 于LAMP检测OXA48家族基因也屡现不鲜， 但检测方式不尽相同。 如有学者使用荧光定量PCR 仪进行LAMP反应， 可以实时记录曲线， 进行定性与半定量检测， 但该仪器昂贵， 需要专业人 员进行仪器操作； 有学者还使用羟基萘酚蓝作为LAMP的显色剂， 反应大约1小时左右， 但羟 基萘酚蓝颜色变化 不明显， 不同的人肉眼观测， 误差较大。 发明内容 [0004]本发明要解决的技术问题， 是要提供一种LAMP检测耐碳青霉烯酶阴沟肠杆菌 OXA48家族基因的引物组合物及相应的试剂盒， 该引物组合物的序列设计合理， 特异性强，说　明　书 1/7 页 3 CN 114350761 A 3