(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210056989.2 (22)申请日 2022.01.18 (71)申请人 上海伯杰医疗科技股份有限公司 地址 201415 上海市奉贤区沪杭公路158 8 号3号楼1302、 1303、 1304、 1305、 1306、 1307、 1309室 (72)发明人 沈林　朱兆奎　杨运真　 (74)专利代理 机构 北京路浩知识产权代理有限 公司 11002 专利代理师 李梦楠 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6869(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种肠道A组病毒全基因组测序的方法及其 应用 (57)摘要 本发明涉及基因组学技术领域， 尤其涉及一 种肠道A组病毒全基因组测序的方法及其应用。 所述方法中采用包括如下序列的引物对： EVA_ 01F： 5’ ‑TTAAAACAGCCTGTCGGTTG ‑3’； EVA_01R： 5’ ‑GCTATTCTGGTTATAACAACTTTACC ‑3’。 本发明提 供了一对特异性引物， 仅凭借这一对引物就可以 实现现有肠道A组病毒的全基因组序列的富集， 一次性捕获肠道A组病毒全基因组能力高， 在肠 道A组病毒全基因组测序的领域具有重要意 义。 权利要求书1页 说明书7页 序列表18页 附图3页 CN 114480735 A 2022.05.13 CN 114480735 A 1.一种引物对， 其特 征在于， 包括： EVA_01F： 5’ ‑TTAAAACAGCCTGTCGGTTG‑3’； EVA_01R： 5’ ‑GCTATTCTGGTTATAACAACTTTACC‑3’。 2.一种试剂盒， 其特 征在于， 所述试剂盒包括权利要求1所述的引物对。 3.根据权利要求2所述的试剂盒， 其特 征在于所述试剂盒还 包括： 常规PCR扩增试剂、 PCR产物纯化试剂和DNA文库构建试剂。 4.权利要求1所述的引物对， 或权利要求2或3所述的试剂 盒在肠道A 组病毒全基因组测 序中的应用。 5.一种肠道A组病毒全基因组测序的方法， 其特征在于， 所述方法中采用权利要求1所 述的引物对进行全基因 组片段的扩增。 6.根据权利要求5所述的方法， 其特征在于， 包括： 采用权利要求1所述的引物对针对待 测序样品进行PCR扩增， 后经过酶切片段化、 末端修复与A尾添加、 接头连接、 文库纯化及片 段分选、 文库扩增、 文库纯化、 文库质检和 测序。 7.根据权利 要求6所述的方法， 其特征在于， 以总体系为25 μL计， 所述PCR扩增的反应体 系包括： 2×One Step Mix 10～15 μL、 One  Step Enzyme Mix 1～1.5 μL、 EVA_01F  1.5～2.5 μL、 EVA_01R 1.5～2.5 μL和RNA  4～6 μL， 余 量为水。 8.根据权利要求6或7 所述的方法， 其特 征在于， 所述PCR扩增的反应程序如下： 45～55℃， 25～35min； 90～95℃， 1～2min； 90～95℃30～60s， 65～70℃6～8min， 32～ 35个循环； 65～70℃8～12mi n； 4～8℃保持。 9.权利要求4 ‑8任一项所述的方法在提高肠道A组病毒的全基因组测序的效率中的应 用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114480735 A 2一种肠道A组病毒全基因组测序的方 法及其应用 技术领域 [0001]本发明涉及基因组学技术领域， 尤其涉及一种肠道A组病毒全基因组测序的方法 及其应用。 背景技术 [0002]肠道A组病毒包括很多亚型(柯萨奇A组， 埃可A组， 肠道A组)， 且极易发生突变及重 组， 其中主流的亚型包括EV71， CA6， CA10， CA16， CA4 等等。 [0003]现有技术中， 关于肠道A组病毒的全基因测序技术， 主要有两类， 第一类通过叠瓦 式设计单一亚型的全基因组扩增引物， 并用一代/二代测序来获得病毒基因组序列， 此方法 的局限性在于肠道A组病毒亚型种类较多， 针对每一亚型设计引物工作量较大， 并且叠瓦式 方法设计的全基因组扩增引物数目较多， 不易操作且易交叉污染。 第二类通过设计肠道A组 病毒捕获探针， 此方法的局限性在于不同探针的捕获能力不均一， 探针成本高， 操作复杂， 难以高效扩增肠道 A组病毒的全基因 组序列。 发明内容 [0004]为了解决现有技术存在的问题， 本发明提供一种肠道A组病毒全基因组测序的方 法及其应用， 通过 特定的引物对， 实现均一 性捕获肠道 A组病毒全基因 组。 [0005]第一方面， 本发明提供一种引物对， 包括： [0006]EVA_01F： 5’ ‑TTAAAACAGCCTGTCGGTTG‑3’； [0007]EVA_01R： 5’ ‑GCTATTCTGGTTATAACAACTTTACC‑3’。 [0008]进一步地， 本发明提供一种包括所述引物对的试剂盒。 [0009]进一步地， 所述试剂盒还包括常规PCR扩增试剂、 PC R产物纯化试剂和D NA文库构建 试剂。 [0010]本发明进一步提供所述引 物对， 或所述试剂盒在肠道A组病毒全基因组测序 中的 应用。 [0011]第二方面， 本 发明提供一种肠道A组病毒全基因组测 序的方法， 所述方法 中采用所 述引物对进行全基因 组片段的扩增。 [0012]本发明针对GENEBANK现有的肠道A组病毒全基因组序列设计了1对特异性引物， PCR靶向富集肠道A组病毒， 覆盖度达到肠道A组病毒98％以上区域， 不仅能够准确的用来获 得肠道A组病毒的基因 组序列， 用于流行病学分析， 而且成本低， 操作简单。 [0013]进一步地， 所述方法包括： [0014]采用所述引物对针对待测序样品进行PCR扩增， 后经过酶切片段化、 末端修复与A 尾添加、 接 头连接、 文库纯化及片段分选、 文库扩增、 文库纯化、 文库质检和 测序。 [0015]进一步地， 以总体系为25 μL计， 所述PCR扩增的反应 体系包括： [0016]2×One Step Mix 10～15μL、 One  Step Enzyme Mix 1～1.5μL、 EVA_01F  1.5～ 2.5 μL、 EV A_01R 1.5～2.5 μL和RNA  4～6 μL， 余 量为水。说　明　书 1/7 页 3 CN 114480735 A 3