(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210065272.4 (22)申请日 2022.01.18 (71)申请人 北京林业大 学 地址 100083 北京市海淀区清华 东路35号 北京林业大 学 (72)发明人 陶静　骆有庆　任利利　庄佳敏　 张赛男　武海卫　 (74)专利代理 机构 北京路浩知识产权代理有限 公司 11002 专利代理师 商秀玲 (51)Int.Cl. C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/6888(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) (54)发明名称 一种松材线虫入侵林分褐梗天牛快速分子 检测方法 (57)摘要 本发明涉及分子检测技术领域， 具体涉及一 种松材线虫入侵林分褐梗天牛快速分子检测方 法。 本发明提供褐梗天牛特异性引物对， 可在短 时间内快速、 准确地检测褐梗天牛； 本发明提供 的快速分子检测方法不受虫态和地理种群的限 制， 对除成虫以外的其它虫态(卵、 幼虫和蛹)也 可进行鉴定。 采用本发明提供的特异性引物， 可 用于松材线虫侵染林中褐梗天牛的快速鉴定， 及 时清理带虫木， 防止媒介昆虫被人为传播到其他 地区， 以期能有效控制松材线虫的进一步传播和 扩散。 权利要求书1页 说明书7页 序列表3页 附图3页 CN 114480376 A 2022.05.13 CN 114480376 A 1.引物对， 其特 征在于， 所述引物对的核苷酸序列如SEQ  ID No.1‑2所示。 2.权利要求1所述的引物对在制备检测褐梗天牛的试剂或试剂盒中的应用。 3.含有权利要求1所述引物对的试剂或试剂盒。 4.权利要求1所述的引物对或权利要求3所述的试剂或试剂盒在褐梗天牛检测中的应 用。 5.权利要求1所述的引物对或权利要求3所述的试剂或试剂盒在松材线虫检测中的应 用。 6.权利要求1所述的引物对或权利要求3所述的试剂或试剂盒在林场松材线虫或褐梗 天牛防治中的应用。 7.权利要求1所述的引物对或权利要求3所述的试剂或试剂盒在木质包装材料、 疫木、 电缆盘、 光 缆盘中褐梗天牛的快速准确鉴定中的应用。 8.根据权利要求4 ‑7任一项所述的应用， 其特征在于， 采用权利要求1所述的引物对或 权利要求3所述的试剂或试剂盒对待测物品进行PCR扩增， 若 能扩增出条带， 所述待测物品 中含有褐梗天牛。 9.一种检测褐梗天牛的方法， 其特征在于， 使用权利要求1所述的引物对或权利要求3 所述的试剂或试剂盒对待测样品进 行PCR扩增， 若能扩增出条带， 所述待测样品中含有褐梗 天牛。 10.一种预防松材线虫病的方法， 其特征在于， 使用权利要求1所述的引物对或权利要 求3所述的试剂或试剂盒对待测样品进行PCR扩增， 若能扩增出条带， 所述待测样品中含有 褐梗天牛， 将携带褐梗天牛的带 虫木进行清理。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114480376 A 2一种松材线虫入侵林分褐梗天牛快速分子检测方 法 技术领域 [0001]本发明涉及分子检测技术领域， 具体涉及 一种松材线虫入侵林分褐梗天牛快速分 子检测方法。 背景技术 [0002]松材线虫病又称松树枯萎病(pine  wilt disease， PWN)， 是由松材线虫寄生松树 引起的具有毁灭性的检疫性森林病害， 被称作松树的 “癌症”。 松材线虫本身不具备自主传 播能力， 主要依靠媒介昆虫携带进行短距离传播， 而其长距离传播主要是借助媒介昆虫和 疫木携带通过物质运输、 人类活动传播。 因此， 控制媒介昆虫， 是松材线虫病防控的重要途 径。 [0003]褐梗天牛Arhopalus  rusticus(Linnaeus)又称褐幽天牛， 属鞘翅目 (Celeoptera)， 天牛科(Cerambycidae)， 幽天牛亚科(Aseminae)， 梗天牛属(Arhopalus)。 Linit等研究发现褐梗天牛可以携带扩散型松材线虫(Linit,1988)。 此后， 大量研究发现褐 梗天牛可以携带松材线虫， 并认为褐梗天牛可能会传播松材线虫(Mamiya  and Tamura, 1977； Ridley  et al.,2001； Maja  et al.,2012)。 高娜等(2013)通过对褐梗天牛及松墨天 牛的生态位进行分析， 认为褐梗天牛极有可能携带并传播松材线虫。 王洋(2020)通过室内 实验研究发现， 褐梗天牛成虫羽化后可取食黑松针叶， 仅吸取汁液不取食植物组织， 可在针 叶表面造成取食伤口并可从取食枝条中分离到松材线虫。 另外， 侯瑞(2019)研究发现褐梗 天牛携带形态与 松材线虫扩散型4龄幼虫一致的线 虫， 此现象与 松墨天牛携带松材线 虫、 传 播松材线虫病的规 律一致。 因此， 褐梗天牛同样是松材线虫的潜在媒介昆虫。 [0004]目前， 褐梗天牛的鉴定方法主要依据成虫形态特征的传统形态学鉴定方法和基于 DNA条形码技术检测方法， 而实际检疫 过程中常常遇到标本受损或非成虫等情况。 在传统形 态学鉴定工作中， 需要专业的昆虫分类知识； 同时， 其卵、 幼虫、 蛹三个虫态下， 褐梗天牛与 其它天牛科的形态特征也极其相似。 因此， 在松材线 虫入侵林分内， 不同虫态的 限制实现褐 梗天牛的准确鉴定， 已成为亟 待解决的问题。 [0005]近些年， 分子生物学的快速发展已为昆虫快速准确地鉴定提供了强有力的技术支 撑。 DNA条形码技术鉴定方法利用线粒体的细胞色素氧化酶I基因(COI)对通过样品获取、 DNA提取、 PCR扩增、 公司序列测定等过程获得的序列经过美国国家生物信息技术中心 (NCBI)提供的在 线序列对比程序(BLAST)快速而准确地鉴定物种。 然而， 此方法需要经过第 三方公司参与测序， 耗费时间较长 。 发明内容 [0006]对于天牛的形态鉴定， 需要鉴定者具备扎实的专业基础以及丰富的经验， 且只有 在获得成虫时才可完成鉴定工作， 处于卵、 幼虫、 蛹这三个虫态的天牛科昆虫形态上极其相 似。 同时， 实际检疫过程中常常会遇到标本受损等情况， 使 得形态鉴定难以进 行； DNA条形码 检测技术虽然可将样品进行测序后通过序列比对鉴定种类， 但需要第三方公司测序， 耗费说　明　书 1/7 页 3 CN 114480376 A 3