(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210065299.3 (22)申请日 2022.01.18 (71)申请人 深圳市兰科植物保护研究中心 地址 518000 广东省深圳市罗湖区东湖街 道望桐路8 89号 (72)发明人 王志才　王美娜　赵美丽　张晓捷　 李健　崔洪秋　 (74)专利代理 机构 南京求真专利代理事务所 (普通合伙) 32600 专利代理师 刘骐鸣 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6809(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 DcBGLU2L石斛多糖含量分子标记及其开发 方法与应用 (57)摘要 本发明公开了一种DcBGLU2L石斛多糖含量 分子标记及其开发方法与应用。 采用兰花组织培 养中常用的两种植物激 素NAA和6 ‑BA处理铁皮石 斛幼苗， 对铁皮石斛幼苗中的主要药用化合物进 行了比较分析， 并对相应样品进行转录组测序分 析差异表达基因， 明确了不同处理条件下化合物 积累和差异基因表达模式的对应关系。 其中， DcBGLU2L基因表达与多糖含 量密切相关， 其表 达 水平可以指示多糖积累水平， 因此可以作为指示 多糖含量的分子标记； 可 以应用在生产实践中， 对不同激 素处理、 不同浓度、 不同处理时间、 不同 生长时期受体材料中的多糖含量进行监测； 也为 人工控制石斛活性成分的生产铺平了道路。 权利要求书1页 说明书5页 附图5页 CN 114480707 A 2022.05.13 CN 114480707 A 1.一种DcBGLU2L石 斛多糖含量分子标记， 其特征在于， 分子标记DcBGLU2L在 NCBI gene  bank中的基因检索编号为Loc110095182， 通过引物对以石斛RNA反转录的cDNA为模板， 采用 qRT‑PCR扩增来指示 其表达水平。 2.根据权利 要求1所述的DcBGLU2L石斛多糖含量分子标记， 其特征在于， 所述引物对为 SEQ ID NO.1和SEQ  ID NO.2； 所述的SEQ  ID NO.1序列为： 5' ‑CTTTCAGCAAATCAGAATCCCA‑3'； 所述的SEQ  ID NO.2序列为： 5' ‑ATGCCTGACTGGTTGGTGGA‑3'。 3.权利要求1所述的DcBGLU2L石斛多糖含量分子标记的开发方法， 其特征在于， 对组织 培养中激素 处理后的石斛样品进 行qRT‑PCR基因表达检测， 与对照样品进 行比较， 其表达量 与多糖含量呈正相关 关系， 据此判断多糖含量的变化情况。 4.根据权利 要求3所述的DcBGLU2L石斛多糖含量分子标记的开发方法， 其特征在于， 所 述qRT‑PCR基因表达检测具体为， 取用少量样品进行微量RNA提取及逆转录成cDNA， 采用 qRT‑PCR方法对DcBGLU2L基因表达水平进行检测 和比较。 5.根据权利 要求4所述的DcBGLU2L石斛多糖含量分子标记的开发方法， 其特征在于， 所 述少量样品为5 0‑100mg的植物组织鲜样。 6.根据权利要求4或5所述的DcBGLU2L石斛多糖含量分子标记的开发方法， 其特征在 于， 所述少量样品为叶片、 1cm长的茎、 根部组织、 圆球 体或愈伤组织。 7.根据权利 要求3所述的DcBGLU2L石斛多糖含量分子标记的开发方法， 其特征在于， 利 用RNAi敲低DcBGLU2L的表达， 样品中多糖含量相应降低。 8.根据权利要求3所述的DcBGLU2L石斛多糖含量分子标记的开发方法， 其特征在于步 骤如下： 步骤1.石斛材 料处理； 步骤2.多糖含量测定； 步骤3.cDNA文库制备和转录组测序； 步骤4.转录组数据处 理与分析； 步骤5.实时定量qRT ‑PCR验证； 步骤6.RNAi 敲低DcBGLU2L的表达及对应材 料中多糖含量测定 。 9.权利要求1所述的DcBGLU2L石斛多糖含量分子标记的应用， 其特征在于， 作 为监测多 糖含量的分子标记， 在监测石斛体内多糖含量、 指示石斛体内多糖的积累水平、 检测石斛质 量、 鉴定石斛品质、 研究植物激素对石斛活性成分积累的影响及研究植物激素处理下改变 化合物积累的潜在机制中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114480707 A 2DcBGLU2L石斛多糖含量分子标记及其开发方 法与应用 技术领域 [0001]本发明涉及生物技术领域， 特别是一种DcBGLU2L石斛多糖含量分子标记及其开发 方法与应用。 背景技术 [0002]石斛属是兰科植物中最大的属之一， 在世界范围内包含1500多种， 具有很高的经 济和科学研究价值。 铁 皮石斛(D.officinale)是一种广泛分布于亚洲亚热带的濒 危多年生 附生草本植物， 被列为最珍贵的石斛属植物之一， 具有健胃、 促进体液分泌、 调节免疫、 抑癌 等多种功效。 其茎中含有 多种活性成分， 主 要包括多糖、 生物碱、 黄酮类、 酚类等。 [0003]铁皮石斛根据消费者的喜好可以果汁、 粉末、 胶囊和功能性酒或茶的形式广泛用 于药物和膳食补 充剂， 导致对 该物种的需求不断增加以及农业生产集约化。 据报道， 2018年 中国南方有6000多公顷的农地用于生产近2 万多吨铁 皮石斛鲜条。 因此， 铁皮石斛生产的质 量至关重要， 它会受到多种遗传和环境因素的影响， 导 致其活性成分含量 不稳定。 [0004]目前在铁皮石斛快繁体系中广泛使用的培养基诱导种子萌发导致了后代表型性 状和药用品质不稳定。 因此， 如何准确在铁皮石斛组织培养扩繁的生产过程中对多糖等活 性成分的实时监测， 并根据监测结果进行培 养基微调是确保产品 品质稳定的关键环 节。 发明内容 [0005]本发明提供了一种DcBGLU2L石斛多糖含量分子标记及其开发方法与应用， 以实现 实时、 可跟踪的监测不同激素处理、 不同处理时间、 不同浓度、 不同生长时期受体材料中多 糖含量。 [0006]实现本发明目的 的技术解决方案为： 一种DcBGLU2L石斛多糖含量分子标记， 分子标记D cBGLU2L在NCBI gene bank中的 基因检索编 号为Loc110095182， 通过引物对以石斛RNA反转录的cDNA为模板， 采用qRT ‑PCR 扩增来指示 其表达水平。 [0007]优选的， 所述引物对为SEQ  ID NO.1和SEQ  ID NO.2； 所述的SEQ  ID NO.1序列为： 5' ‑CTTTCAGCAAATCAGAATCCCA‑3'； 所述的SEQ  ID NO.2序列为： 5' ‑ATGCCTGACTGGTTGGTGGA‑3'。 [0008]一种DcBGLU2L石斛多糖含量分子标记的开发方法， 对组织培养中激素处理后的石 斛样品进行qRT ‑PCR基因表达检测， 与对照样品进行比较， 其表达量与多糖含量呈正相关关 系， 据此判断多糖含量的变化情况。 [0009]优选的， 所述qRT ‑PCR基因表达检测具体为， 取用少量样品进行微量RNA提取及逆 转录成cDNA， 采用qRT ‑PCR方法对DcBGLU2L基因表达水平进行检测 和比较。 [0010]优选的， 所述少量样品为5 0‑100mg的植物组织鲜样。 [0011]优选的， 所述少量样品为叶片、 1cm长的茎、 根部组织、 圆球 体或愈伤组织。 [0012]优选的， 利用RNAi 敲低DcBGLU2L的表达， 样品中多糖含量相应降低。说　明　书 1/5 页 3 CN 114480707 A 3