(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210062348.8 (22)申请日 2022.01.19 (71)申请人 中国疾病预防控制中心传染病预防 控制所 地址 102206 北京市昌平区昌百路15 5号 (72)发明人 秦爱平　熊衍文　邵祝君　 (74)专利代理 机构 北京路浩知识产权代理有限 公司 11002 专利代理师 黄爽 (51)Int.Cl. C12Q 1/6844(2018.01) C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/04(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 适于低丰度样本 检测的RPA扩增方法 (57)摘要 本发明提供一种适于低丰度样 本检测的RPA 扩增方法， 包括两轮RPA扩增反应： 第一轮反应以 提取的样本DNA为模板， 利用引 物RPA‑F和RPA‑R 进行基础RPA扩增； 第二轮反应以第一轮反应产 物为模板， 利用引物RPA ‑F和RPA‑R‑biotin以及 探针进行RPA ‑nfo扩增(方案eRPA1.1)； 进一步 地， 在进行第一轮反应之前， 先用去抑制剂处理 提取的样本DNA， 再进行 RPA扩增(方案eRPA2.1)。 不同于传统巢式RPA需要2对引物， 本发明e RPA技 术只需设计1对引物， 利用方案e RPA1.1、 e RPA2.1 极大提高了RPA对现场、 临床样本中靶核酸的检 出率。 使RPA检测技术从实验室转化于实际成为 可能。 权利要求书3页 说明书11页 序列表2页 附图2页 CN 114540465 A 2022.05.27 CN 114540465 A 1.适于低丰度样本检测的RPA扩增方法， 其特征在于， 包括两轮RPA扩增反应： 第一轮反 应是以提取的样本DNA为模板， 利用引物RPA ‑F和RPA‑R进行基础 RPA扩增； 第二轮反应是以 第一轮反应产物为模板， 利用引物RPA ‑F和RPA‑R‑biotin以及探针进行RPA ‑nfo扩增； 其中， 引物RPA ‑F和RPA‑R是针对靶核酸设计的； 探针位于引物RPA ‑F和RPA‑R的扩增子内， 探针5 ’端标记荧光基团， 5 ’端下游30 ‑33bp处 标记核酸外切酶识别位 点THF， 探针3 ’端经磷酸 化修饰。 2.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 在进行第一轮反应之前， 先用去抑制剂处 理提取的样本DNA， 再进行RPA扩增； 所述去抑制剂包含rCutsmart  buffer和内切酶Xhol， 其中rCutsmart  buffer购自NEB 公司； 去抑制反应 体系如下： 去抑制反应条件： 瞬 间离心， 37℃放置20 ‑60min。 3.非诊断目的检测立克次氏体的方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： 1)提取待测样本总DNA， 或经去抑制剂处 理后的待测样本总DNA； 2)配制含有上、 下游引物的基础RPA反应体系， 向反应体系中加入上述提取的总DNA， 进 行第一轮RPA扩增； 3)配制含有上、 下游引物和探针的RPA ‑nfo反应体系， 向反应体系中加入第一轮扩增产 物， 进行第二轮RPA扩增； 4)分析扩增产物； 其中， 上游引物为： 5 ’ ‑AATTCACAACTTGCCATTGTCCGTCAGGTT‑3’ 下游引物为： 5 ’ ‑CTGTAACGGTCCAGGCGGTATGAATAAACA‑3’ 探针为： 5 ’ ‑FAM‑CCGGATTACGCCATTCTACGTTACTACCAC[THF]AGGAGCTCTTTCTAAAG ‑ C3Spacer‑3’ 所述去抑制剂包含rCutsmart  buffer和内切酶Xhol， 其中rCutsmart  buffer购自NEB 公司。 4.根据权利要求3所述的方法， 其特 征在于， 第一轮RPA反应 体系包括：权　利　要　求　书 1/3 页 2 CN 114540465 A 2其中， 基础RPA冻干粉管包 含噬菌体同源重组酶、 DNA聚合酶、 单链结合蛋白和dNTPs。 5.根据权利要求 4所述的方法， 其特 征在于， 第二轮RPA反应 体系包括： 其中， RPA‑nfo冻干粉管包含噬菌体同源重组酶、 DNA聚合酶、 单链结合蛋白、 dNTPs及核 酸外切酶。 6.根据权利要求3 ‑5任一项所述的方法， 其特征在于， RPA扩增条件为： 30 ‑45℃， 15 ‑ 60min。 7.非诊断目的检测恙虫病东方体的方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： 1)提取待测样本总DNA， 或经去抑制剂处 理后的待测样本总DNA； 2)配制含有上、 下游引物的基础RPA反应体系， 向反应体系中加入上述提取的总DNA， 进 行第一轮RPA扩增； 3)配制含有上、 下游引物和探针的RPA ‑nfo反应体系， 向反应体系中加入第一轮扩增产 物， 进行第二轮RPA扩增； 4)分析扩增产物； 其中， 上游引物为： 5 ’ ‑GTATCAACAAGAAGTGTTCTTAGGTTCTGG‑3’ 下游引物为： 5 ’ ‑CCTTCAAGATTAAACATCGGTCCACGAAAG‑3’ 探针为： 5 ’ ‑Digoxin ‑CATGATGGTTCAGAACTGATAGCAGAATTA[THF]TTGGCAGTGACAATA ‑ C3Spacer‑3’ 所述去抑制剂包含rCutsmart  buffer和内切酶Xhol， 其中rCutsmart  buffer购自NEB 公司。 8.根据权利要求7 所述的方法， 其特 征在于， 第一轮RPA反应 体系包括：权　利　要　求　书 2/3 页 3 CN 114540465 A 3