(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210057809.2 (22)申请日 2022.01.19 (71)申请人 象山县农业经济特产技 术推广中心 地址 315700 浙江省宁波市象山县丹 城莱 薰路15号 (72)发明人 徐阳　洪丹丹　周慧芬　柏德玟　 曹锦萍　柯甫志　张琮　余朝旭　 俞波　 (74)专利代理 机构 宁波甬恒专利代理事务所 (普通合伙) 33270 代理人 罗继亮 (51)Int.Cl. A01G 17/00(2006.01) A01G 2/30(2018.01) C12Q 1/689(2018.01)C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/94(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (54)发明名称 一种多胚 柑橘品种快速脱除病毒病的方法 (57)摘要 本申请公开了一种多胚柑橘品种快速脱除 病毒病的方法， 包括以下步骤： S1获取种子： 通过 人工异花授粉获得多胚柑橘品种的种子； S2叶片 鉴定： 取萌芽后的多胚柑橘的叶片鉴定有无病 毒； S3移栽高接： 取多胚柑橘无病毒幼苗的茎尖 高接到基砧上； S4获取母本： 多胚柑橘完全成熟、 并鉴定珠心 胚后代与母本株性状一致后， 获得母 本脱毒株。 本发 明的目的在于提供了一种多胚柑 橘品种快速脱除病毒病的方法， 运用一种新的思 路解决多胚柑橘品种带毒种苗快速脱毒， 其脱毒 周期短， 脱 毒效果好， 成活率高。 权利要求书2页 说明书8页 CN 114391410 A 2022.04.26 CN 114391410 A 1.一种多胚 柑橘品种快速脱除病毒病的方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： S1获取种子： 通过 人工异花授粉获得多胚 柑橘品种的种子； S2叶片鉴定： 取 萌芽后的多胚 柑橘的叶片鉴定有无病毒； S3移栽高接： 取多胚 柑橘无病毒幼苗的茎尖高接 到基砧上； S4获取母本： 多胚柑橘完全成熟、 并鉴定珠心胚后代与母本株性状一致后， 获得母本脱 毒株。 2.如权利要求1所述的一种 多胚柑橘品种快速脱除病 毒病的方法， 其特征在于， 所述步 骤S2中， 通过实时荧光定量P CR检测， 其检测病毒包括柑橘黄龙病、 柑橘黄脉病毒、 柑橘衰退 病毒、 温州蜜柑萎缩病毒和柑橘碎叶病。 3.如权利要求2所述的一种 多胚柑橘品种快速脱除病 毒病的方法， 其特征在于： 柑橘黄 龙病菌荧光定量PCR检测反应体系包括2 ×Premix Ex Taq、 250nM的上下游引物、 150nM探 针、 待测样品DNA和无菌双蒸水； 反应在Bio ‑rad CFX96TMPCR仪上进行， 扩增程序如下为95 ℃预变性2min， 95℃10s， 58℃30s， 40个循环， 柑橘黄龙病用荧光定量PCR检测的引物为 HLBas:5‑TCGAGCGCGTATGCAATACG ‑3′、 HLBr:5 ′ ‑GCGTTATCCCGTAGAAAAAGGTAG ‑3′、 和探针 HLBP:5′ ‑AGACGGGTGAGTAACGCG ‑3′(探针： 5′FAM标记， 3 ′BHQ‑1标记)； 用于柑橘黄脉病毒常 规PCR检测的引物为TGB ‑1f:ATGGACTTACCTGAGCTCCTG,TGB ‑1R:TCAGGAGGAGGTTGTAGAGGCA； 用于柑橘衰退病毒常规PCR检测的引物为CTV ‑CP1:ATGGACGACGAAACAAAG,CTV ‑CP3： TCAACGTGTGTTGAATTT； 用于柑橘萎缩病毒常规PCR检测的引物为SDV ‑CM: CAGAAATCAAGAAAAA CAC， SDV‑CP:GGGAAAGCTGCTTATTTAGG； 用于柑橘碎叶病毒常规PCR检测的 引物为CTLV ‑Fn:CCCTCTCAGCTAGA ATTGAA,CTLV‑Rn:AGAGTG GACAAACTCTAGAC 。 4.如权利要求1所述的一种 多胚柑橘品种快速脱除病 毒病的方法， 其特征在于， 所述步 骤S1中， 选取花粉萌芽能力强的品种 作为雄株， 以需要脱毒的柑橘品种 作为雌株， 采摘花粉 已萌发的雄株雄蕊授粉至去雄且尚未露柱授精的雌株雌蕊上， 授粉后套袋， 果实成熟后剥 种获得种子 。 5.如权利要求1所述的一种 多胚柑橘品种快速脱除病 毒病的方法， 其特征在于， 所述步 骤S1中， 多胚有核柑橘品种通过采收成熟果实剥种获得种子， 多胚无核柑橘品种通过异花 授粉获得种子 。 6.如权利要求1所述的一种 多胚柑橘品种快速脱除病 毒病的方法， 其特征在于， 所述步 骤S1与所述 步骤S2之间还 包括步骤： S5消毒播种： 对多胚 柑橘的种子进行 热处理后采用清洁基质进行播种； 其中， 将获得的种子清洗干净后用38～42度的温水预热13～17分钟， 再放入预先调好 的51～55度温水中进行热处理， 经48～52分钟后取出种子， 培养土基质采用无菌泥炭土和 蛭石， 使恒温恒湿培养箱温度控制在28～30度， 相对湿度控制在85％ ‑95％， 光照量采用全 光照量并控制在180 0～2200lx。 7.如权利要求1所述的一种 多胚柑橘品种快速脱除病 毒病的方法， 其特征在于， 所述步 骤S3与步骤S4之间还 包括： S6形成母枝： 将高接后的嫩芽留单枝连续放梢， 待单杆生长至2米以上的高度， 斜向拉 直单杆主枝， 形成结果母枝。 8.如权利要求1所述的一种 多胚柑橘品种快速脱除病 毒病的方法， 其特征在于： 所述步权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114391410 A 2骤S3与步骤S4之间还 包括： S7防治落 果： 开花后使用保果药物， 以防治自然生理落 果。 9.如权利要求1所述的一种 多胚柑橘品种快速脱除病 毒病的方法， 其特征在于： 所述步 骤S3中， 将无病毒幼苗茎尖高接 到3年生以上且干径达 到3cm以上的基砧上。 10.如权利要求1所述的一种多胚柑橘品种快速脱除病毒病的方法， 其特征在于： 所述 步骤S3中， 选用早 花、 易花、 生长迅速的砧木品种大苗作为基砧。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114391410 A 3